猪冷冻精液的生产和使用方法

李兆华

（吉林省农业科学院，吉林 长春 130033）

人工授精在猪的繁殖培育中应用已比较普遍。如何在生猪产业中像养牛生产一样方便快捷地使用冷冻精液，一直困扰着一线的技术和生产人员。在借鉴牛冻精生产与应用经验基础上，利用猪冷冻精液进行人工授精并成功产下仔猪后，众多科研工作者对猪冷冻精液技术进行了一系列深入的研究。目前，英国、美国、加拿大等一些国家的育种公司已经有猪冷冻精液的产品进行出售，但解冻后的精子活率以及配种后的受胎率、产仔数与常温保存猪精液的效果还有一定的差距。现在，中国商品化的猪冷冻精液的应用效果比国外的要好。近5年来，我国猪冷冻精液技术的研究取得了长足的进步。猪冷冻精液这个相对的新鲜事物已经为业内人士所熟悉。市场前景十分看好，目前，国内多家业内知名企业十分重视猪冷冻精液商业化的生产和销售。

文章将从猪冷冻精液的生产制作、解冻与输精3个方面进行梳理与总结，希望能加深广大读者对猪冷冻精液这个相对新鲜事物的进一步了解。

1 冷冻精液的生产制作

主要包括精液的采集、品质鉴定、稀释、平衡、冷冻、低温保存几个步骤。

1.1 精液采集

采集猪精液是制作猪冷冻精液的第一个步骤。方法为手握采精法（如图1），大型公猪站也可使用自动采精器采精（如图2）。

建议采精得到全部猪精液再进行后续的生产操作。因为在实际生产中，采集得到精液后，将精液进行稀释操作之前必定会有一定的时间间隔，不可能马上稀释。若精液不进行及时的稀释，浓度过高的原精在未经过稀释处理的状态下，活力会很快下降，从而影响精液冷冻保存后的质量。

1.2 品质鉴定

通过外观检查和利用显微镜对精液的品质进行鉴定，确保用于冷冻保存的原精的质量符合要求。

1.2.1 外观检查

外观检查就是感官检查，通过视觉、嗅觉对精液的外观、气味、数量进行评定。通常精液呈云雾状的乳白色，颜色深浅与精子的密度有关，异常颜色有暗红色、黄、绿等，可能是生殖道出血和感染化脓所致；略带腥味；1次全精量为200～400 mL左右，射精量极少或极多，均不宜使用。

1.2.2 显微镜检查

就是利用显微镜对精子的状况进行观察。内容包括活率、密度和形态。

活率一般采用目测法估计，为了能真实反映精子的状况，需要配备带有恒温台的显微镜进行观察。根据视野中相对直线运动精子的数量占总精子数的比率来评估。通常采用0.0～1.0的形式进行记录，数值越高活率越好。也可使用计算机系统进行检查。

原精的精子密度一般为2亿～3亿/mL。可使用目测法、血细胞计数法、便携式精子密度仪和计算机系统来测定精子密度。

目测法可粗略地将精子的密度评定为：密、中、稀。密是指视野中充满精子，精子间紧密相连；中是指精子间空隙明显；稀是指精子间空隙间隙超过1个精子以上。如图3所示。目测法要求技术人员要有足够的经验并且主观性较大，最为方便和快捷，在常温液态保存精液的生产中较为常用。但此法不适合冷冻精液的生产，因为只有准确的密度才能保证生产出的每个剂量的冷冻精液中精子的准确数量。

血细胞计数法可准确地测定每 ml精液中的精子数量。将精液滴到盖玻片旁，如图4和图5，利用虹吸作用使精液均匀分布在盖玻片和血细胞计数板之间，在放大400～600倍的条件下观察并计数。血细胞计数板上刻有25个大方格，随机计算5个大方格中精子的总数，然后推算精子密度。计算公式为：精子密度=5个中方格总精子数×5×10×1 000×稀释倍数，如图6。此法最为准确，但也最费时费力。

便携式精子密度仪和计算机系统可以快速准确的测定出精子的密度。但是需要一定的投资，并且在使用过程中也需要利用血细胞计数法进行校对。如图7、图8。

精子正常的形态，是精子生物学功能的前提保障。形态检查通常将精子畸形率以及顶体异常率作为精子形态的主要指标。两者都需要先对精子进行染色，然后将载玻片放在400倍的显微镜下进行观察，记录若干个视野中200个左右的精子中畸形或顶体异常精子占计数总精子的百分比。

精子畸形主要发生在精子头部、颈部和尾部，表现为头部缺损、巨头、微头、双头、无头、双尾、无尾、颈部弯曲等。猪精液中精子畸形率应小于18%。精子顶体异常表现为顶体的膨胀、缺损和脱落，在正常猪精液中，精子顶体异常率不超过2%。若两者的数值过高则表示精液品质较差不适合用于输精，更不适合用于冷冻精液的生产制作。研究证明顶体完整率和不返情率之间比精子活率与不返情率之间相关性更重要。

1.3 原精稀释与平衡

稀释液配方是影响猪精液冷冻效果最主要的因素，之所以近5年来国内在猪精液冷冻技术上取得了很大的进步，主要就是因为配方的改进比较成功。配方成分按照功能划分主要有营养物质、缓冲剂、抗氧化剂、抗冻剂和其他添加剂。营养物质包括葡萄糖、BSA等；缓冲剂包括磷酸盐、EDTA、柠檬酸钠等；抗氧化剂包括维生素E、番茄红素、褪黑素、谷胱甘肽等；抗冻剂包括甘油、乙酰胺、核糖醇、卵黄、木糖醇和二甲基亚砜等；添加剂包括咖啡因、生殖激素、乙酮可可碱、细胞因子、氨基多糖、抗生素等。

稀释与平衡相辅相成或者说是交替进行的。稀释倍数要根据原精液的活率、密度以及每个冷冻剂量（每个细管）中含有的有效精子数而定。现以一种公开的稀释平衡程序为例进行说明：采集到的新鲜精液应尽快在等温条件下进行第一次稀释（2～4倍），25 ℃条件下平衡1 h，然后17 ℃条件下平衡2 h，800 g、17 ℃条件下离心，再用稀释液等温重悬浮后，4 ℃条件下平衡3 h，再加入含有甘油的稀释液，灌装。

1.4 冷冻和保存

猪精液冷冻的形式主要包括细管、颗粒、袋装和安瓿四种。细管形式是将平衡后的精液吸入聚氯乙烯细管中，冷冻后，再浸入液氮中保存。目前绝大多数的猪冷冻精液都用这种形式。其特点是不易受污染，冷冻效果好，体积小，便于贮存运输和机械化生产。

猪精液可以使用干冰、液态氮、液态氦作为冷源进行冷冻。现在不论是熏蒸法还是程序冷冻仪都以液氮为冷源。其主要操作方法为在距离液氮面一定的高度熏蒸一定的时间，也可使用程序冷冻仪。然后放入液氮中保存。保存期间要注意液氮罐中的液氮量，原则上细管要浸泡在液氮中。

2 解冻

冷冻精液使用水浴解冻，温度通常为0～5 ℃、30～40 ℃和50～70 ℃三个范围，其中利用热水解冻，是目前最常用的方法。从液氮中取出的细管，快速地放入到水浴锅或水浴杯中进行解冻。解冻时间随温度的提高而减少，具体情况要根据产品的说明来进行。解冻后细管里的精液要用解冻液进行稀释。稀释液要预先加热到30 ℃左右，然后在显微镜下检查复苏后精子的活率。解冻液的配方对于解冻后精子活率有很大的影响。有研究表明加安钠咖注射液、葡萄糖、柠檬酸钠混合稀释液和精清会有较好解冻效果。

3 输精

输精是猪冷冻精液实际应用的关键所在。通常猪人工授精的输精方法分为常规输精和深部输精。

常规输精也就是子宫颈输精，如图9，输精部位在子宫颈口前端。需有效精子数30亿左右，输精剂量在80～100 mL，因输精位置比较靠外，输精后精液易倒流（输精后1 h内约有30%～40%）。有研究表明，输入子宫颈的30亿精子经过重重障碍到达受精部位的精子数大约只有1 000个。因此，要想获得理想的受精效果，需要较大的输精量，包括精液体积和有效精子数。据报道，用猪冷冻精液进行子宫颈输精，即使输精量比常温精液多很多，受胎率和产仔数仍比常温精液要低。

深部输精顾名思义比常规输精的部位要深。根据输精部位的不同可分为子宫体输精、子宫角输精和输卵管输精。其中输卵管输精法需要微创手术和内窥镜的方法将精液直接输入母猪子宫和输卵管的交界部位；子宫角输精法则需要特制的内导管，使输精部位在子宫角近端的1/3处。这两种方法因为技术操作复杂、耗时费力，成本较高，需要较高的专业水平和极为熟练的技术操作，主要应用于要求较高的科研试验。不适合生产实际应用。见图10和11。

使用猪冷冻精液进行配种时，建议采用深部输精技术，而且是子宫体输精法，见图12。子宫体输精法常用的输精管有两种：管内袋式，如美国生产的AMG管。外观与普通输精管基本相似，但在输精管的顶部连接一个可延展的橡胶软管（置于输精管内部），在输精初期通过用力挤压输精瓶，使橡胶软管向子宫内翻出，穿过子宫颈将精液导入子宫体内。另外一种是管内管式：在常规输精管内部加有一支细的、半软的、长度常规输精管约15 cm的内导管，能够在常规输精管内部延伸以通过子宫颈进入子宫体。见图13和图14。有研究表明，采用子宫体输精法，每次输精的有效精子数只有10亿也不影响受胎率和产仔数。

猪冷冻精液是个相对新鲜事物，因为到目前为止，研究猪冷冻精液技术已经有将近60多年的时间。最早在1957年就有应用猪冷冻精液配种产出仔猪的报道。但是因为解冻后精液的质量与鲜精和常温保存精液的质量相比，仍有较大的差距，造成母猪的受胎率和产仔数一直较低，除了在引种和保种等方面有一定的意义，对养猪业的实际生产中的经济效益并没有突出的贡献。但是随着国内近几年猪精液冷冻液保存技术的进步，猪冷冻解冻后精液的质量相较于常温保存精液的质量没有很大差距，采用冷冻精液繁育的种猪在受胎率和产仔数方面均得到了很大地提高，这使得猪冷冻精液真正商业化应用成为可能。