猪冷冻精液标准化生产技术与管理要点

陈清森 ，张泽宏 ，罗威才 ，公维华 ，朱丽霞

（1.闽南师范大学福建省现代生猪产业体系漳州推广站，福建 漳州 363000；2.福建省海新集团有限公司，福建 漳州 363100）

1 背景

伴随着养猪业的发展，猪人工授精技术也得到了不断发展，在2007年时我国猪平均人工授精率仍较低，为25% ～30%，其中的95%以上的精液是来自于规模化猪场的场内公猪站，商业化公猪站所占的比例极小；而此时在养猪发达国家，商业化猪人工授精率占50% ～ 90%，单头公猪精液年产量也高出我国 200 ～ 1 000头份。到了2015年后，随着国内一批养猪龙头企业，如广西扬翔、天邦集团、广东谷越、广州猪仙子、上海祥欣等企业在种猪育种、精液与耗材业务的宣传推进，猪商业化供精得到基本共识，通过这些龙头企业的顶层设计，我国猪人工授精产业的基因品质、产精效率与产品效果与世界先进水平的差距不断缩小，在单体规模、配送距离上甚至领先世界。

同时自2018年起，我国也面临着非洲猪瘟疫情的挑战，猪鲜精的推广与使用受到了一定的限制，冻精业务得到了进一步的发展，随着史上最好行情的到来，单头肉猪的利润达到4 000元，支撑了昂贵冻精的使用。

2 冻精生产的前提条件

2.1 首先要有优秀的顶级公猪

1）公猪的主要经济性状的表型值需要非常优秀与稳定，要有能够给猪场带来巨大经济价值的潜力，根据作者及团队测算，在核心群上1元的基因相对价值，通过扩繁群、商品群的放大，可以实现10 000元回报的可能性，这个超过多数类型投资回报，这也是国家一直大力支持猪育种战略的原因所在。

2）公猪的系谱信息要完整准确，通过基因检测，可以进一步验证系谱的准确性。作者在2013年丹麦学习时，发现每1头参加国家测定站测定的送测猪，都要经过基因检测做系谱验证，一旦有误，之前参加测定入选到公猪站的所有猪只、进入系统的所有数据，都要删除，非常严格。可见原始记录是基础，基因手段是验证，是叠加作用，不能认为有了亲子鉴定，就可以在现场记录上有任何的松懈。

3）公猪的精液品质优良，各种指标能适合冻精生产，这体现了公猪的个体差异，并不是所有公猪的精液都适合鲜精生产与冻精生产，并实现可以接受的配种成绩，因此顶级公猪必须经过生产验证以后，方可大量制作冻精，大量推广。否则由于人工授精技术的放大作用，损失也一样被放大。

2.2 备份特别的基因类型

1）冻精技术在濒危动物的保种上有着广泛的应用，如犀牛、熊猫、东北虎等数量极少，在野外自然条件下存活量极少的物种。

2）通过冻精技术来备份与中华文明相伴而行的古老动物品种，未来可能有很强的战略价值，如我国的地方品种猪、牛、羊等。其主要原因是：第一，地方品种猪、牛、羊数量相对较少；第二，相对于主流的商业程度高的畜禽品种，这些品种存在独特性，如太湖猪的超长、超明显发情与高产特征，如陆川猪的肉质细腻、风味独特、性格温和、适应高温高湿环境的特性。

2.3 良好的冻精应用推广能力

1）显然养猪龙头企业，在猪冻精生产应用上比较有条件与必要性。除了前文所述的企业，还有如广东早期的种猪企业、温氏、天兆等企业，对冻精都有广泛的应用。

2）国内外也有公猪站生产冻精出售，如美国的SGI、加拿大的OSI、北京的百钧达等，通过引入经过权威机构严格认证的优质公猪，不做专业化的育种饲养，而只做专业化公猪站管理与精液生产销售，这时公猪的品质与来源就非常重要了，以美国SGI为例，当年测定拍卖排名第一的优秀公猪，购买价格达到10万～20万元人民币，为公司带来巨大的经济与品牌价值。

3）现在国内还出现了第三方制作冻精服务业务，拥有成熟的技术与解决方案，可以帮助有需求的企业实现标准化生产，一次投入较大，但从长远发展来看，更方便，维持费用低。

3 冻精标准化生产工艺与流程

猪的冻精有多种规格，如5 mL大管、0.5 mL细管、袋装等，这里以生产0.5 mL细管、含精子总数 5亿个来介绍生产流程。

3.1 鲜精的采集与检测

1）精液采集

技术人员需手戴一次性无菌乳胶手套，利用徒手法进行精液采集，采用带有过滤网的通用型无菌精液袋，滤掉胶状物，只收集中间富含精子部分的精液。

2）精液的检测

①精液体积

将精液袋放入容器中，用电子天平可准确测定质量，以1 g约等于1 mL计算。

②精子浓度

采用美国MOFA公司的光度计进行测定，按照说明书进行操作。具体操作步骤如下：用标准板对光度计进行3次读数校正，3次读数应完全一致；测定时移取 20 μL精液于一次性加样板中，避免产生气泡或溢出，将加样板置于光度计中读出精子浓度，读取3次，取平均值。

③精子活力、细菌污染等级与结团等级

采用 Olympus CX-41相差显微成像系统，参照陈清森等（2005）的标准进行检测。分别检测定以下性状：精子活力、细菌污染等级、结团等级。

④精子形态的检测

计数中间型幼稚型精子比例、颈部脂滴幼稚型精子比例，总异常精子比例。

⑤计算精液有效总精子数，理论生产头份数与实产头份数

有效总精子数＝ 体积（mL）×浓度（Bill/mL）×活力（%）

可稀释头份数与实产头份数按每份含有效精子数40亿来计算。

3.2 精液的稀释与离心

1）计算好将与精液等温的专用稀释液混合到精液中，混匀；

2）把混合液放进 17 ℃ 恒温箱，液体温度达 17 ℃ 后平衡后，进行离心操作；

3）把混合液装入 50 mL的离心瓶里，在 17 ℃ 和离心力 800 g 的条件下离心 20 min；

4）吸走上清液，测量上清液的体积和浓度，计算出上清液中总精子数并减掉，即可算出可用精子数。

3.3 加冷却营养稀释剂与冷却

1）加冷却营养稀释剂， 最后要调到10 亿/mL精子的最终浓度， 把 17 ℃ 的冷却营养稀释液缓慢地加到沉淀精液中，以吸吐方式混合均匀，合并。 此时当中大约一半是冷却营养稀释液，另一半是冻凝营养稀释液。

2）把精液瓶置于 17 ℃ 的水浴杯里，再一同放进 5 ℃ 冰箱冷却1.5 h，要观测精液温度，达到 5 ℃ 时，再继续冷却 45 min。

3.4 加冻凝营养稀释剂，装管封口

1）按计算好的量，把 5 ℃的冻凝营养稀释剂缓慢地加到 5 ℃ 的精液中， 轻轻晃动使其混合均匀。

2）在 5 ℃的冷却室或操作箱里，加入冻凝剂后 15 min内，把精液装入 0.5 mL事先打印好标记的吸管里，封口。把吸管里的气泡摇到中间，以防吸管解冻时发生泄漏，甚至爆裂。

3.5 冻凝精液细管

1）在程序降温仪的冻腔里，以1 min下降30 ℃ 的速度充液氮把精液细管冻凝，冻凝曲线可参考见表1。

2）用夹钳把冻好的精液细管从冻腔里拿出，立即将细管全身浸入液氮中并整理到细管架中，迅速把细管架转移到液氮罐中。

4 冻精成品的日常管理要点

1）冻精必须时刻储藏在液氮罐中，并保持液氮罐中有充足的液氮，以维持足够合适的低温。通过监测液氮罐的重量变化，与确定好的最小重量进行比对，一旦液氮罐接近最小重量，需要马上补充液氮。通常各种类型的液氮罐每天挥发的液氮重量是0.14～0.5 kg，需要4～20 d补充1次液氮。

2）备份并打印出液氮罐中各个细管架上各细管的信息，与公猪的系谱信息相对应，才能在需要时方便快速取出所需要的冻精。

3）操作过程当中，要注意通风、防冻伤等，严格按照各种规范要求操作。

5 小结

对于公猪种群极其优秀与特别的企业，若有制作冻精的必要性，可以自行制作，也可以外包。但无论是冻精的生产还是使用，均需要优秀的猪群建设与日常管理，才能实现价值的最大化与高程度的生产力转化。

借此感谢美国MOFA公司、美国SGI公司、加拿大OSI等同行朋友对本文的支持。

表 1 降温参考曲线

参考文献（略）