过敏性鼻炎患儿血浆miR-487b、IL-33的表达及临床意义

李满群, 许清河

1湖州市第一人民医院耳鼻喉科(浙江湖州 313000)； 2湖州市中心医院药剂科(浙江湖州 313000)

过敏性鼻炎是机体接触变应原后，主要由IgE介导的鼻黏膜非感染性炎性疾病，属于速发型(1型)变态反应，其病理可能是机体受到变应原刺激后多种免疫活性细胞参与的疾病过程[1]，常反复发作影响患儿的日常及学习生活。Chia等[2]认为白细胞介素-33(interleukin 33，IL-33)通过活化巨噬细胞可能导致过敏性哮喘加重时气道炎症加剧。近几年来关于微小RNA的报道日渐增多，其中有研究认为微小RNA-487b(mircoRNA-487b，miR-487b)可以负向调控IL-33/ST2信号通路，诱导肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)表达降低，减轻脓毒症炎症反应[3]。也有研究显示miR-487b通过控制IL-33转录蛋白质的水平来微调这些细胞的固有免疫宿主防御和促炎反应，从而在巨噬细胞中发挥负调控作用[4]。因此，本研究从炎症角度入手针对miR-487b、IL-33在过敏性鼻炎患儿血浆中的表达水平，探讨其临床意义以期对未来的临床工作提供一定依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2019年8月于本院耳鼻喉门诊确诊并治疗的过敏性鼻炎患儿共110例作为观察组，其中男57例，女53例，年龄(7.20±2.61)岁。

纳入标准：过敏性鼻炎患儿诊断标准参照2009年中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编委会和中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组制订的《变应性鼻炎诊断和治疗指南》[5]。

排除标准：(1)近期使用过抗过敏药物、抗组胺药、激素等治疗的过敏性鼻炎患儿；(2)合并过敏性哮喘、哮喘等肺部疾病患儿；(3)有鼻腔手术史者；(4)严重心、肝、肾疾病患儿；(5)脑部器质性病变或癫痫患儿。

同期选取于本院体检结果为健康者120例作为对照组，其中男58例，女62例，年龄(6.97±1.08)岁。两组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。

本研究中所有患者均由主治以上医师明确诊断，本试验经医院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准，所有受试对象均由专业人员详细告知研究内容并自愿参加，并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 转录试剂盒(货号：DEM201-20T)购自北京拜尔迪生物技术有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(货号：RR037A)及TRIzol试剂(货号：JMS12279)均购自日本TaKaRa公司；台式高速冷冻离心机(MiniSpin)购自德国Eppendorf公司；恒温恒湿箱(LHS-250HCN)购自上海轩仪仪器设备有限公司；实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：MiniAmp)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Human IL-33 ELISA kit(JK-A-1494)、TNF-α ELISA kit(JK-A-0016)、CRP ELISA kit(JK-A-5084)均购自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样本采集与处理 两组受试者均于门诊检查时取肘静脉血3 mL，肝素抗凝，3 500 r/min离心10 min，收集上清液后注入EP管，-20℃低温冰箱保存待测定。

1.3.2 实时荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)测定过敏性鼻炎患儿血浆中miR-487b的表达水平 从-80℃取出血浆样本，恢复室温后按试剂盒说明书提取血浆总RNA，异丙醇沉淀浓缩后，用75%酒精洗涤，干燥后加入100 μL DEPC水，检测所得RNA纯度及完整度；按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，产物置于-20℃保存备用。qRT-PCR反应(反应体系20 μL)：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA(50 ng/μL)模板2 μL，上下游引物各1 μL，水6 μL，每个样本设置3个平行。上下游引物、内参基因由上海恒斐生物科技有限公司设计并合成，miR-487b以U6为内参，引物序列见表1。反应条件：95℃预变性8 min；90℃变性20 s、60℃退火40 s，72℃延伸25 s，40个循环，每个循环72℃收集荧光。采用2-ΔΔCt法计算血浆中miR-487b相对表达量。

1.3.3 酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法测定两组受试者血浆中IL-33以及炎症相关指标TNF-α、CRP的表达水平 采用ELISA法检测两组受试者血浆中IL-33、TNF-α、CRP的表达水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

表1 qRT-PCR引物序列

血浆中miR-487b、IL-33表达的相关性；绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析过敏性鼻炎患儿血浆中miR-487b、IL-33表达对过敏性鼻炎发病的预测价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般情况比较 两组受试者年龄、性别、身高、BMI差异均无统计学意义(P>0.05)，家族史比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组一般临床特征资料比较

2.2 两组受试者血浆中miR-487b、IL-33表达水平的比较 观察组患儿血浆中miR-487b表达水平显著低于对照组，IL-33、TNF-α、CRP表达高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组受试者血浆中miR-487b、IL-33表达水平的比较

2.3 过敏性鼻炎患儿血浆中miR-487b、IL-33、TNF-α、CRP表达水平的相关性 过敏性鼻炎患儿血浆中miR-487b与TNF-α、CRP表达均呈负相关(r=-0.531、-0.455，P<0.05)，IL-33与TNF-α、CRP均呈正相关(r=0.620、0.587，P<0.05)，miR-487b、IL-33表达呈负相关(r=-0.641，P=0.000)。见表4。

表4 过敏性鼻炎患儿血浆中miR-487b、IL-33与TNF-α、CRP表达水平的相关性

2.4 过敏性鼻炎患儿血浆中miR-487b、IL-33表达水平对过敏性鼻炎发病的预测价值 ROC曲线显示，血浆中miR-487b预测过敏性鼻炎发生的ROC曲线下面积为0.837(95%CI：0.784～0.891)，截断值为0.965，敏感度为92.7%，特异度为65.8%；血浆中IL-33预测过敏性鼻炎发生的ROC曲线下面积为0.898(95%CI：0.855～0.940)，截断值为67.001 ng/L，敏感度为77.3%，特异度为89.2%。见图1。

3 讨论

过敏性鼻炎是一种常见而难治的非感染性鼻黏膜炎性疾病，主要由体内过敏原暴露后IgE介导，其发病机制可能与炎症反应和机体免疫功能有关[6]。目前公认的机制为抗原进入致敏个体内引起相关炎症介质释放和炎症细胞聚集，大多数抗原为吸入性抗原，以尘螨和花粉最常见,越来越多的研究强调疾病个体的免疫系统的整体性[7]。儿童过敏性鼻炎的典型症状包括喷嚏、清水样涕、鼻痒和鼻塞，典型体征为双侧鼻黏膜苍白、水肿、鼻腔有水样分泌物，眼部主要为结膜充血、水肿[8]。胡晓春等[9]认为过敏性鼻炎发病的独立危险因素为频繁呼吸道感染、吸烟、过敏史(药物、花粉等)、家族鼻炎史。由于患儿不会主诉症状，症状常不典型且易与感冒相混淆，使得儿童过敏性鼻炎难以被及时发现，因此相关指标的检测显得尤为重要。本研究结果中过敏性鼻炎患儿血浆中TNF-α、CRP表达均高于对照组，提示此时过敏性鼻炎患儿正经历某种程度的炎性反应过程，猜测可能是由于个体免疫在接触过敏原时调动炎性细胞因子分泌。

图1 过敏性鼻炎患儿血浆中miR-487b、IL-33水平对发病的预测价值

IL-33是一种新近发现的细胞因子，IL-33通过与ST2结合直接或间接地介导过敏性鼻炎发病的各种细胞活化，促进Th2型炎性细胞因子的释放[10]。IL-33在变应性鼻炎机制发生时与多种炎性细胞构成复杂的网络相互作用，导致IgE产生、黏液分泌增加及组织嗜酸性粒细胞浸润，共同促进变应性鼻炎的发生与发展[11]。胡琛等[12]学者发现过敏性鼻炎患者相比于健康人群血清中TNF-α、IL-33、TLR4和NF-κB呈高表达状态，且糖皮质激素治疗后过敏性鼻炎患者血清内TNF-α、IL-33、TLR4和NF-κB的表达显著降低。本研究结果中，过敏性鼻炎患儿血浆中IL-33表达水平高于对照组，提示IL-33在过敏性鼻炎进程中起到一定作用，或存在某种参与机制，猜测IL-33可促进过敏性鼻炎各种炎性细胞因子释放，导致IgE分泌从而引起患儿过敏性鼻炎速发，或可通过TLR4/NF-κB通路，尚处于炎症反应过程中，出现刺激气道黏膜、鼻黏膜等情况，患儿出现流涕、喷嚏等典型症状。

miR-487b在多种疾病机制中都有所表达。Wang等[13]发现miR-487b可通过抑制IL-33/ST2信号通路抑制IL-33，从而减少慢性心力衰竭中的炎症反应、延缓心肌纤维化。Liu等[14]发现IL-33可能是miR-487b的直接靶标，变应性鼻炎患者鼻黏膜组织中IL-33及其特异性配体ST2水平升高，而miR-487b表达水平明显降低；过敏性鼻炎模型小鼠miR-487b上调可以抑制IL-33和ST2表达，从而导致IL-33和ST2表达降低，miR-487b在变应性鼻炎中起到抑制作用，miR-487b/IL-33-ST2轴可能是治疗变应性鼻炎的潜在治疗靶标。本研究结果中，miR-487b在过敏性鼻炎患儿血浆中呈低表达，提示miR-487b参与过敏性鼻炎的发生发展过程，猜测miR-487b在过敏性鼻炎发生过程中或起到抑制炎症反应的作用，其上调可抑制IL-33及其配体ST2表达，miR-487b可能是过敏性鼻炎的相关有效检测指标。

本研究结果显示miR-487b与IL-33表达呈负相关，这与研究文献所得出的结果基本一致，可能存在miR-487b/IL-33-ST2轴以调节过敏性鼻炎发生过程中相关因子释放，但相关因子具体表达如何仍需进一步研究。而miR-487b表达与TNF-α、CRP表达呈负相关，猜测miR-487b可起到抑制过敏性鼻炎所引起的相关炎性反应，同时IL-33与TNF-α、CRP表达呈正相关，猜测IL-33与TNF-α、CRP可能共存于某种由机体免疫调动的炎性反应机制之中。另经ROC曲线提示当检测miR-487b表达水平低于0.965、IL-33表达水平高于67.001 ng/L时患儿可能速发过敏性鼻炎，家属应密切观察，早确诊早治疗，以减缓患儿病情的严重程度，但由于过敏性鼻炎多速发难治，miR-487b与IL-33可作为辅助检测指标。

综上所述，过敏性鼻炎患儿血浆中miR-487b呈低表达、IL-33呈高表达，两者具有一定负相关，可能是预测过敏性鼻炎发病的良好辅助指标。但本研究仍存在一些问题，如过敏性患儿样本数较少、尚未研究IL-33配体ST2的表达情况，未来可针对这两个问题进行补充研究。