黔产商陆醇提物对HeLa 细胞增殖的影响

岳重群 杨 锦 李 哲 吴静澜 韩 伟*

（贵州中医药大学，贵州 贵阳550025）

商陆（Phytolaccae Radix）为商陆科植物，药用部位为商陆Phytolacca acinosa Roxb. 或垂序商陆Phytolacca americana L.的干燥根，秋季至次春对药材进行采收[1]。商陆是贵州省常见的中药材，合理的开发利用商陆资源是十分必要的。研究发现，商陆中含有多种化学成分，包括：三萜皂苷类、黄酮类、酚酸类、甾醇类、多糖类等[2]。中医认为商陆具有逐水消肿，通利二便，外用解毒散结的功能[1]。现代药理学研究发现，商陆具有抗肿瘤、抗炎、提高免疫力、利尿等作用[3]。本文前期查阅文献发现，商陆中主要抗肿瘤活性成分以商陆多糖、商陆皂苷、商陆抗病毒蛋白等研究较多[4-7]，而对商陆脂溶性成分的抗肿瘤作用研究较少。因此，本文研究商陆脂溶性成分对人宫颈癌HeLa 细胞活性作用，通过研究丰富商陆抗肿瘤活性成分，为进一步研究商陆提供科学依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

AG135 型分析天平（美国 Mettler Toledo 公司）、BHC-1300IIA/B2 型生物安全柜（苏州净化设备有限公司）、H150i 型二氧化碳培养箱（美国Thermo 公司）、BE2000 型倒置荧光显微镜（重庆澳浦光电技术有限公司）、TGL16M型高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机有限公司）、SB-4200D 型超声清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）、DNM-9606 型酶标仪（上海珂淮仪器有限公司）、F3 型单道移液器（美国Thermo 公司）、F3型30～300 μL 八道移液器（美国Thermo 公司）。

1.2 试剂

MTT 试剂（Biosharp 公司）、PBS（Biosharp 公司）、DMEM培养基（美国Gbico 公司）、胎牛血清（美国Gbico 公司）、青霉素- 链霉素（Beyotime Biotechnology 公司）、胰蛋白酶（Beyotime Biotechnology 公司）。

1.3 细胞株

人宫颈癌HeL a 细胞，由中国典型培养物保藏中心提供。

1.4 药材

商陆采自于贵州中医药大学校园内，经中药鉴定教研室张爽老师鉴定为垂序商陆Phytolacca americana L.。

2 方法

2.1 商陆脂溶性成分的提取和纯化

取商陆药材100 g，捣碎，置于2000 mL 提取瓶中，加800 mL 95 %乙醇后用电热套加热提取，2 h 后倒出滤液，商陆滤渣继续加600 mL 95 %乙醇提取2 h，提取完后加合并滤液，再将滤液用旋转蒸发仪后收集样品。采用AB-8 大孔树脂（使用前先用95 %乙醇浸泡24 h，使用时用蒸馏水冲洗至无醇味）对商陆提取物进行梯度洗脱（从低浓度到高浓度，洗脱至无颜色再换到另一梯度），分别收集30 %、50 %、70 %、95 %组分样品，用旋转蒸发仪将收集的各组分溶剂挥干备用。

2.2 HeLa 细胞培养

人宫颈癌HeLa 细胞复苏后，培养瓶中加入完全培养基（10%胎牛血清+1 %青霉素- 链霉素+89 %DMEM培养基）进行培养，置于37 C、5 % CO2细胞培养箱中，隔天换液。当细胞在显微镜下总数到80 %左右，PBS 润洗，加入0.25 %的胰蛋白酶消化细胞2 min，加入等量的完全培养基，1000 rpm 离心5 min，倒掉上清液，细胞沉淀加入完全培养基，移液器轻轻吹散，传代或进行后续实验。

2.3 MTT 法测定脂溶性成分对HeLa 细胞增殖的影响

待HeLa 细胞达到对数期，将细胞进行上述操作，细胞浓度稀释到6×104/mL，采用八道移液器将细胞加入96 孔板中；待细胞贴壁后，除空白对照组外，30 %、50 %、70 %、95 %组分四种样品，每种分别配制终浓度为1、5、10、25、50、100 μg·mL-1的样品加入细胞中，每个浓度设置6 个复孔；待48 h 后避光加入10 μL 5mg·mL-1的MTT 溶液，放置培养箱内继续孵育4 h，然后吸取每孔细胞上清液，加入DMSO 100 μL，摇床震摇10 min，在490 nm 处测定吸光度OD 值，计算细胞存活率。

2.4 统计学分析

采用SPSS 17.0 软件进行数据处理，各组差异采用ANOVA检验分析，所得数据以x ±SD 表示，P < 0.05 表示显著性差异，P < 0.01 表示极显著性差异。

3 结果与讨论

3.1 30 %组分对HeLa 细胞增殖的影响

在0～100 μg·mL-1范围内，48 h 后随着商陆各组分浓度的增加，药物对HeLa 细胞存活率有抑制作用，浓度在25 μg·mL-1其对细胞产生抑制作用，当浓度＞50 μg·mL-1时，细胞存活率明显降低，30 %商陆各组分对HeLa 细胞的抑制程度与剂量相关，结果见表1。

表1 30%商陆组分对HeLa 细胞存活率的作用

3.2 50 %组分对HeLa 细胞增殖的影响

当50 %商陆组分浓度为25 μg·mL-1其对细胞产生抑制作用，当浓度＞50 μg·mL-1时，此浓度跟30 %对细胞存活率相同，并呈现浓度依赖型抑制细胞，结果见表2。

表2 50%商陆组分对HeLa 细胞存活率的作用

3.3 70 %组分对HeLa 细胞增殖的影响

70 %商陆组分对细胞损伤程度较强，在低浓度为5 μg·mL-1时，就对肿瘤细胞具有较好的抑制作用，同时随着浓度增加，细胞存活率下降，结果见表3。

表3 70%商陆组分对HeLa 细胞存活率的作用

3.4 95 %组分对HeLa 细胞增殖的影响

95 %商陆组分同样对细胞损伤程度较强，浓度为5 μg·mL-1时，就对肿瘤细胞具有抑制作用，同时随着浓度增加，细胞抑制率上升，结果见表4。

表4 30%商陆组分对HeLa 细胞存活率的作用

4 结论

本文对商陆药材进行95 %乙醇提取，提取物中脂溶性成分含量较多；通过AB-8 大孔树脂梯度洗脱，得到30 %、50 %、70%、95 %四种不同组分。商陆各组分对HeLa 细胞的增殖均有一定的抑制作用且抑制程度与剂量呈正相关。其中70 %和95 %组分具有的抗肿瘤活性且较30%和50 %组分抗肿瘤活性强，在浓度为5 μg·mL-1时，即对肿瘤细胞增殖有抑制作用，且随着浓度增加抑制作用加强。因此，本文推测商陆药材中脂溶性成分也发挥着抑制肿瘤生长作用，其中生物碱类、有机酸类等脂溶性成分也是从商陆中分离出来[7]，如：阿魏酸有文献报到其具有抑制人胃癌SGC-7901 细胞增殖及调节相关凋亡基因的作用[8]；β- 谷甾醇可以抑制SGC-7901 细胞生长，促进凋亡，其机制可能跟PI3K/AKT/m TOR 通路诱导细胞自噬作用相关[9]。因此，研究相关脂溶性成分对于抗肿瘤作用也是十分有意义的。通过对商陆醇提物各纯化组分的抗肿瘤活性研究，可以深化对商陆的科学认识，为商陆的综合利用提供科学依据。