基于基因编码的高时空分辨率检测去甲肾上腺素荧光探针

去甲肾上腺素 (norepinephrine, NE) 是一种重要的单胺类神经递质，参与多种生理过程。NE 的释放或信号传递过程受损与多种精神疾病和神经退行性病变相关。因此，以高时空分辨率的方式检测神经环路中内源NE 的动态分布，对解析NE 在生理及病理条件下的功能尤为重要。然而现有的技术无法精确检测去甲肾上腺素的在体分布。北京大学李毓龙研究组开发并优化了一类基于G 蛋白偶联受体 (GPCR) 激活的NE 荧光探针 (GRABNE)，通过在人源NE 受体特定位置嵌入对结构变化敏感的荧光蛋白 (cpEGFP)，使化学信号转化为荧光信号，结合现有的成像技术，实时监测NE 的动态变化。结果：①探针优化：将膜转运能力最强α2-肾上腺素能受体 (α2AR) 作为cpEGFP 支架，将cpEGFP 插入到α2AR 第三胞内环域(ICL3)中，通过突变靠近cpEGFP 的C1 位置氨基酸设计出荧光性能较好的探针GRABNE1m（低亲和力）；通过点突变α2AR 中T6.34K 设计出对NE 灵敏度更高的探针GRABNE1h（高亲和力）。②细胞实验表明，在HEK293T 细胞和神经元中表达GRABNE1h，GRABNE 能够在离体细胞中特异性地反应NE 的动态变化且不会诱导GPCR 下游信号的改变。③脑片电生理实验表明，通过在培养的海马脑片中表达GRABNE1m和GRABNE1h探针，能够监测NE的动态变化且对内源性NE 受体功能无影响。电刺激海马脑片可引起GRABNE1h荧光增强，且对神经元的兴奋性没有明显干扰。在蓝斑 (LC) 中表达GRABNE1m后，电刺激引起NE 的释放能够快速诱导荧光强度增加，表明GRABNE1m能够敏感且特异性地实时监测内源性NE 的释放。④斑马鱼动物实验：在转基因斑马鱼Tg (HuC:GRABNE1m) 全脑神经元上广泛表达GRABNE1M探针，能够成功检测到清醒斑马鱼中脑由视觉刺激引发的与时间锁定的特异性NE 释放，通过稀疏标记GRABNE1M探针记录到单细胞分辨率下重复视觉刺激引发的NE释放信号，表明探针能够直接监测在体NE 的动态变化。⑤Th-Cre 小鼠动物实验：在Th-Cre 小鼠的LC 中病毒表达GRABNE1m（非Cre 依赖）和光遗传致动器C1V1（Cre 依赖），通过光遗传给予刺激，光纤光度记录发现自由活动小鼠中GRABNE1m荧光强度增加且能够特异性反映NE 水平，表明GRABNE 探针能够用于监测哺乳动物大脑中的NE 动态变化。⑥C57BL/6 小鼠动物实验：在小鼠外侧下丘脑中表达hSyn-GRABNE1m。在强迫游泳和悬尾应激性实验中，GRABNE1m荧光强度显著增加。而在社交或饮食行为中，并未发现荧光信号的改变，表明外侧下丘脑的NE 活动主要发生在应激条件下，表明该探针能够检测到应激状态下NE 的动态变化。因此，李毓龙研究组开发的遗传编码的NE 探针(GRABNE1m和GRABNE1h)，可用来监测体外和体内NE 动态变化，具有高时空分辨率，高配体特异性和细胞类型特异性，有助于理解NE 在复杂行为过程中的调节作用。