副猪嗜血杆菌Neu-ELISA 方法的构建及应用

刘俊琦

（永州职业技术学院，湖南永州425000）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）属于巴斯德菌科（Pasteurellaceae）家族成员，为猪上呼吸道初期重要寄生菌[1]。HPS 能引起猪的Glasser’s病，主要通过应激反应或激发感染引起1～4 月龄猪仔猪发病[2]，患病猪出现多发性关节炎、纤维素性浆膜炎、脑膜炎[3]。随着养猪业规模的迅速扩大和养猪模式的改变，近几年本病流行趋势日趋严重，给全球养猪业造成了巨大的经济损失[4]。目前动物疫病检测实验室对本病的诊断主要为流行病学调查、临床症状分析、病理变化检测，细菌学诊断[5]。然而，副猪嗜血杆菌常与其他细菌或病毒混合感染，给兽医临床诊断带来了困难，易造成了误诊、漏诊。已有文献表明大量健康猪只正常携带HPS[1]，但兽医实践中HPS 分离率较低，推测主要是由于HPS 的分离培养易受抗生素或化学治疗剂等因素的影响，且细菌营养条件要求较高，保存时间较短[6-7]。因此，传统的诊断技术已经不能满足现代猪病发展的需求，因此，快速、准确地诊断该病以便采取相应的措施，是成功预防和控制本病的关键。当前市场上用于检测HPS 的商品化ELISA 试剂盒主要以HPS 全菌为包被抗原。由于全菌具有潜在的散毒风险，并且HPS血清型较多又缺乏有效的交叉保护[8-10]，因此研究应用现代分子生物学技术及免疫学技术构建安全、高效的基因工程蛋白ELISA 检测方法乃大势所趋。

神经氨酸酶蛋白（Neuraminidase，Neu）是HPS重要的一个毒力蛋白，该蛋白广泛存在于各血清型PHS[11]。Neu 参与细菌外膜部分[12]，这种脂低聚糖具有唾液酸化作用。Neu 可将唾液酸残基裂解成神经节苷脂-GM1，在转变为asilo-GM1，而该物质是4型菌毛的优先结合物[13]。在其他一些细菌中已证实Neu 参与生物被摸形成并发挥着重要作用[14]。此外，有报道称正是由于Neu 的作用功能，细菌能有效地定植于宿主体内，因此Neu 是发展动物疫苗的候选基因之一[15-16]。

1 材料与方法

1.1 血清及抗原

PHS 阳性血清和阴性血清来自于美国Synbiocits 公司的ELISA 试剂盒。猪链球菌阳性血清、猪胸膜肺炎防线杆菌阳性血清、猪瘟病毒阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清、猪圆环病毒2 型阳性血清均来自于武汉科前生物股份有限公司的ELISA 检测试剂盒；临床待检血清采集于湖南省永州市冷水滩区、东安县、蓝山县、宁远县等地多家猪场，共计血清样品164 份。参照文献[17]由上海生工生物工程（上海）股份有限公司克隆、表达并纯化Neu 蛋白。

1.2 主要试剂

牛血清蛋白（BSA）购自于天津康源生物技术有限公司；胰酶大豆琼脂（TSA）培养基、胰酶大豆肉汤（TSB）培养基购自于上海艾研生物科技有限公司；兔抗猪酶标二抗购自于北京博尔西科技有限公司；96 孔酶标板购自于百千生物公司。

1.3 Neu 重组蛋白最佳包被浓度、血清最佳稀释度的确定

将纯化的New 蛋白稀释浓度为400 ng/100 μL、200 ng/100 μL、100 ng/100 μL、50 ng/100 μL、25 ng/100 μL，取100μL 稀释的Neu 蛋白加入96 孔酶标板。将PHS 血清按照1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320 比例稀释，取100μL 稀释的血清加入96 孔酶标板。参照间接ELISA 操作步骤检测各浓度样本的OD450nm值。将阳性血清的OD450nm值设置为P, 阴性血清的OD450nm设置为N，并以当P/N 值最大时对应的浓度设置为最佳作用浓度。

1.4 抗原抗体反应时间、酶标二抗反应时间、底物显色时间的确定

将抗原、抗体反应时间设置为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，各个时间点设置2个重复。将酶标二抗反应时间设置为15 min、30min、45 min、60 min、75 min、90 min，各个时间点设置2 个重复。将底物显色时间设置为10 min、15 min、20 min、25 min、30min，各个时间点设置2 个重复。各反应均以P/N 值最大时对应的时间为最作用时间。

1.5 特异性试验

应用本研究建立的Neu-ELISA 方法对猪链球菌、猪胸膜肺炎防线杆菌、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2 型阳性血清进行抗体检测，测定其OD450nm值。

1.6 临床待检样品的检测

应用反应条件优化后构建的Neu-ELISA 方法检测64 份临床待检血清，测定待检血清样本OD450nm值。根据检测结果初步测定PHS 在永州地区的流行情况。

2 结果

2.1 Neu-ELISA 最佳反应条件的确定

对构建的Neu-ELISA 反应条件进行筛选，结果表明抗原最佳包被浓度为100 ng/100 μL，血清最佳稀释度为1∶160，抗原、抗体最佳作用时间为60 min，酶标二抗最佳作用时间为60 min，底物显色最佳作用时间为20 min。

2.2 Neu-ELISA 基本操作程序

根据筛选的最佳实验条件，构建Neu-ELISA基本操作程序：用包被液将Neu 蛋白稀释为100 ng/100 μL，取100μL 稀释的Neu 包被96 孔酶标板，先37℃孵育2h，随后4℃过夜吸附；PBST 洗涤液洗涤3～5 次（5 min/ 次）并拍干；每孔加入100 μL 含有0.15%的BSA 封闭液，37 ℃孵育1h，PBST洗涤液洗板3～5 次并拍干；每孔加入100μL 应用PBS 稀释的血清，37℃孵育1h，PBST 洗涤液洗板3～5 次并拍干；每孔加入100μL 稀释的兔抗猪酶标二抗，37℃孵育1h，PBST 洗涤液洗板3～5 次并拍干；加入现配的OPD-H2O2底物显色液，37 ℃避光显色20min；每孔加入50μL 浓度为2mol/L 的H2SO4终止液，测定样品的OD450nm值（图1）。

2.3 Neu-ELISA 特异性试验结果

应用Neu-ELISA 方法分别检测猪链球菌、猪胸膜肺炎防线杆菌、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2 型、副猪嗜血杆菌阳性血清进行检测，结果显示HPS 血清为阳性，其余血清的OD450nm值均小于HPS 为阴性，表明本研究所构建的Neu-ELISA 方法具有较好的特异性（表1）。

表1 Neu-ELISA 特异性试验结果Table 1 The specificity test of Neu-ELISA

2.4 送检临床血清样品检测结果

表2 待检血清Neu-ELISA 抗体的检测结果Table 2 Neu-ELISA results of serum samples

应用本研究所构建的Neu-ELISA 方法对湖南省永州市多地区猪场的164 份待检血清进行检测。Neu-ELISA 检测结果显示，猪场待检血清样品中阳性检出率为19.51%，其中母猪阳性检出率为9.1%，哺乳仔猪阳性检出率为18.33%，育肥猪阳性检出率为23.17%。

3 讨论

目前副猪嗜血杆菌已给全球养猪业造成巨大经济损失，因此建立一种快速、有效的诊断方法迫在眉睫。有研究表明循环抗体的出现与针对HPS系统性感染的保护具有关联性[18]。通过初乳获得被动免疫是仔猪抵抗临床HPS 感染的主要机制[19-20]。当前ELISA 检测方法是检测速度较快、应用最广、商品化较成熟的一种广谱性检测方法[5]。据报道副猪嗜血杆菌具有较多的血清型[8-9]，各血清之间又缺乏有效的交叉保护[10]，且全国各地流行菌株存在较大差异。当前我国市场上所使用的商品化ELISA检测试剂盒主要是以HPS 全菌作为包被抗原，该方法对相同血清型HPS 检测具有很强特异性，但对不同血清型HPS 的准确度明显减低，甚至出现大量假阴性和假阳性。在2011 年前，仅有少量的血清特异性检测方法用于监测HPS 血清样本，但是没有检测方法能测定所有血清型；2011 年Macedo N等人构建了以物种特异性寡核苷酸渗透酶A（OppA）多肽为包被抗原的ELISA 商品化检测试剂盒[21]。OppA 多肽是一个跨膜蛋白且是ABC 转运系统的组成部分[22]，是免疫显现蛋白，由此构建的OppA-ELISA 具有广谱检测性，研究者认为该方法可用于追踪全身性感染，而不用考虑HPS 血清型[21]。重组Neu 蛋白具有较强的免疫原性[15]，是副猪嗜血杆菌的一个重要毒力因子，并且Neu 蛋白是所有血清型菌株都含有的重要蛋白，且Neu 在个血清型HPS 中存在着一定的交叉保护[23]，因此可对各血清型菌株进行检测，准确度会有明显提高。本研究通过对Neu-ELISA 实验条件进行优化，建立了一种快速、高效的ELISA 诊断方法。试验表明本研究构建的Neu-ELISA 方法对诊断副猪嗜血杆菌病具有非常强的特异性。同时笔者应用该研究构建的ELISA 检测方法对164 份采集于永州多地猪场的血清进行检测，结果表明永州地区副猪嗜血杆菌病总感染率为19.51%，其中育肥猪感染率最高，母猪感染率相对较低，本研究为永州地区副猪嗜血杆菌病流行病学调查奠定了研究基础。