前列腺癌患者循环肿瘤细胞研究进展

王永锋 王雪刚 邢金春

前列腺癌是70岁以上老年男性最常见的恶性肿瘤。我国近10年来前列腺癌发病率呈显著上升趋势，前列腺癌的复发或转移是患者死亡的主要原因，其最常见的远处转移是骨转移，晚期可出现脑、肺等远处器官转移。大量研究表明，肿瘤的复发及远处转移与循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)有关。CTC是指从原发肿瘤脱落后侵袭进入血液循环系统中的原发肿瘤细胞，CTC可以通过血液循环系统转移，并且在其他组织发展为转移灶，部分前列腺癌患者早期诊断时已有远处转移，而常规的影像学、组织学或细胞学检查难以发现[1]。临床研究显示血液中CTC的数量与肿瘤的发生、发展及转移密切相关。同时，由于CTC携带有原发灶和转移灶的信息，因此深入分析CTC携带的信息可以指导肿瘤患者用药、检测肿瘤抗药性、及时调整治疗方案等。CTC在前列腺癌的临床分期、疗效监测、预后评估及内分泌治疗中有重要的临床意义。

一、CTC概述

CTC通常指因自发或诊疗操作引起的从原发灶或转移灶侵入人体血液循环的肿瘤细胞。1869年Ashworth首次在癌症死亡患者的血液中发现类似肿瘤的细胞而提出此概念。外周血中的CTCs数量很少，每106～107个血细胞中可能只有1个CTC[2]。外周血中的CTC主要以单个细胞形式独立存在，大部分在短期就会凋亡或被吞噬，极少数的肿瘤细胞会聚集成团形成循环肿瘤微栓子(circulating tumor microemboli, CTM)，跟随血液系统转移到远处器官。部分原发肿瘤细胞经历上皮间转化(epithelial mesenchymal transitions, EMT)等过程获得高侵袭性，从原发组织脱落，侵入周围基质并进入血液循环。

EMT是指在某些特殊的生理或病理条件下，上皮细胞失去极性，转变为具有移行能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程。 EMT发生后，肿瘤细胞上皮标志如E-钙黏素(E-cadherin)和细胞角蛋白(cytokeratin, CK)等表达下调，使细胞侵袭和转移能力增加，导致部分肿瘤细胞从原发组织脱落，侵入周围基质，进入血管或淋巴管，形成CTC，随循环系统播散至远隔部位，穿出脉管后在新的组织环境中生存和繁殖，最终形成转移灶[3]。目前最为常用的CTC分离和富集技术为免疫磁性分离法，此技术是基于上皮细胞标志物如上皮细胞粘附分子(EpCAM)和CK的存在来检测CTC，但是这一检测方法常存在假阴性可能。Kasimir-Bauer等[4]检测502例乳腺癌患者的外周血CTC，结果发现有18%的间质性乳腺癌CTC未被检测到。针对EpCAM的抗体可能无法检测循环肿瘤EMT细胞，最新的CTC检测系统已经可以检测具有EMT形态的CTC，使其检测和分析更加便利[5]。

二、CTC的检测技术

血液中的CTC相对于其他血细胞而言含量较少，在外周血中，约每106～107个血细胞中仅有1个CTC。不同肿瘤类型之间肿瘤细胞的特征和标志物也不尽相同，这就给CTC的检测和标记带来很大的困难。目前各种CTC检测体系主要包括CTC的分离和富集系统以及CTC的检测和鉴定系统。

1.CTC的分离和富集—免疫磁性分离法：通过将带有羧基、氨基及生物素等修饰的Anti-EpCAM抗体与相对应带有羧基、氨基及亲和素等修饰的磁球进行耦合反应，形成对CTC具有特异性捕获能力的免疫磁珠[5]。目前基于免疫磁性原理富集或同时检测CTC的技术主要有CellSearch系统、免疫磁性细胞分选仪及AdnaTest癌细胞检测系统。其中CellSearch系统是目前唯一被美国FDA批准的用于前列腺癌、直肠癌及转移性乳腺癌的CTC的检测技术[6-7]。该系统是通过免疫磁珠捕获细胞后在外磁场存在，可以对CTC进行免疫荧光鉴定并计数[8]。利用该技术，研究人员能够收集前列腺癌患者血液中的CTC，该技术的缺点是采用上皮细胞标志物筛选，会遗漏EMT的肿瘤细胞。

2.基于生物物理原理的富集法：生物物理的富集法是指利用CTC与血细胞在大小、密度和极性等差异，采用过滤、离心等方法实现分离。前列腺癌CTC的直径比血细胞大，前列腺癌细胞的直径约为11 μm，采用微过滤技术，通过精确设定滤膜的孔径，能够滤过血细胞(直径约6.0～9.5 μm)将CTC捕获。为了捕获成簇出现的特异性CTC，Karabacak等[9]近期发明了一种基于微流控技术的三维微过滤芯片，能将成团的CTC截留。总体来说，基于生物物理方法分离的CTC操作较简单，成本也更低，分离后的CTC往往还保留有生物活性。但这种方法也存在一些和血细胞大小相当的CTC难以分离而出现假阳性的情况。

3.CTC的检测和鉴定：常见的检测和鉴定技术主要包括免疫荧光技术、RCR技术、流式细胞分析及光纤阵列扫描技术(fiber-optic array scanning technology, FAST)等。RT-PCR技术以肿瘤细胞的mRNA为标志检测CTC，具有灵敏度高、可重复性好及价格便宜等优势，是目前检测CTC最有效的方法。但是由于检测的是mRNA，在检测过程中需要破坏CTC，导致无法计数，也不能对CTC进行形态学观察[10]。

三、CTC检测在前列腺癌中的应用价值

1.非转移性前列腺癌：Thalgott等[11]研究显示局限性高危前列腺癌患者外周血CTC的阳性率为20%，健康对照组CTC的假阳性率为6.7%；Davis等[12]对97例局限性高危前列腺癌患者行前列腺切除术前的检测发现，21%的患者外周血可以检测到CTC，但同时健康无癌组也有20%的CTC假阳性率，两组之间差异无统计学意义(P=0.946)。前列腺切除术后6周，基线CTC阳性率为16%，阴性率为11%，两组之间差异无统计学意义(P=0.51)。综合以上研究可以发现，在局限性高危前列腺癌患者外周血中CTC的检测阳性率低，无法将外周血CTC检测作为非转移性前列腺癌的诊断依据，这可能与目前CTC检测技术不够灵敏有关。

2.局限性高危前列腺癌：针对这一类患者行根治术前，CTC的检测是否具有预测生化复发的作用，有一些文献进行了相关报道。Meyer等[13]检测了152例拟接受前列腺癌根治术的患者术前外周血CTC，只有17例(11%)发现CTC阳性。经过平均44.3(36～60)个月的随访后，CTC阴性患者和CTC阳性患者的生化复发率分别为68%和72%(P=0.66)，两者差异无统计学意义。据此可以发现在局限性高危前列腺癌患者术前CTC检测阳性率低，术后根据术前的CTC检测结果也不能很好的预测根治术后是否会发生生化复发，因此术前的CTC检测不是预测根治术后生化复发最佳的指标。

3.转移性前列腺癌：①CTC的检测对转移性激素敏感型前列腺癌进展到去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant pristate cancer, CRPC)有明显的预测价值。Goodman等[14]对33例转移性激素敏感型前列腺癌患者接受雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy, ADT)进行研究，发现基线CTC计数是转移性激素敏感型前列腺癌患者进展到CRPC的独立预测因素。并且多因素分析显示基线CTC数量是唯一的独立预测因子。通过对每一个切点CRPC状态对CTC的敏感性和特异性的阈值分析表明，当激素敏感型前列腺癌患者每7.5 ml血中发现超过3个CTC时，进展到CRPC的危险性明显升高。②CTC的检测对CRPC患者的应用价值：转移性前列腺癌给予ADT可使80%的患者病情稳定或缓解，但在经历中位时间为18～30个月的去势治疗后，几乎所有患者最终会进入去势不敏感甚至抵抗阶段，预后普遍较差[15]。Olmos等[16]对119例CRPC患者治疗前CTC计数与总生存期之间的关系进行了研究，研究结果表明CTC≥5的患者的总生存时间为19.5个月，而CTC<5的患者的总生存时间为30个月，两者差异有统计学意义(P<0.05)。此外CRPC的患者经治疗后CTC计数下降>30%的患者具有较好的总生存期(overall survival, OS)。de Bono等[17]也报道了类似的研究结果，对231例进展性CRPC患者进行研究，在化疗前1个月和化疗1个月后检测CTC，发现其中治疗前CTC<5的患者中位OS为21.7个月，而≥5的中位OS为11.5个月，P<0.0 001。经2～5周的治疗后，CTC计数<5的患者中位OS为20.7个月，而经治疗后CTC≥5的患者的中位OS为9.5个月(P<0.0 001)。并且在治疗期间，CTC计数的变化比前列腺特异抗原(prostate specific antigen, PSA)的变化更有预测价值，而且在疗效评估方面可能比PSA更加敏感。一项国际多中心临床试验COU-AA-301[18]中，有研究者发现，在被批准用于进展性前列腺癌的新药阿比特龙的使用中，对711例患者治疗在12周后CTC计数变化+血清乳酸脱氢酶变化与生存的相关性优于PSA的变化。高危组(CTC≥5个细胞/7.5 ml；LDH>250 U/L)、中危组(CTC≥5个细胞/7.5 ml；LDH≤250 U/L)及低危组(CTC<5个细胞/7.5 ml)的中位OS为(8.71 vs. 12.02 vs. 22.18)，差异有统计学意义。这些发现进一步说明了CTC 计数可能成为一个潜在的替代性生物标记来反映患者的治疗效果和生存率。

四、展望

CTC作为一项新兴的前沿技术，在肿瘤的诊断、治疗评估及监测方面有巨大的潜力。尽管CTC的检测还存在阳性率过低等问题，但目前已经有了很大的发展空间。尽管目前的研究结果表明在局限性前列腺癌患者中其作用有限，但对于转移性前列腺癌尤其是CRPC的患者，有大量的研究表明CTC计数是判断前列腺癌预后的敏感因子，为前列腺癌的研究提供了重要依据。尤其是在CRPC患者的新药临床试验中可以看到很好的应用前景。大量以生存时间为主要终点的临床试验，运行的时间更长、成本更大和失败的风险更高。迫切需要可重复和可靠的治疗后检测指标，为这些临床研究提供支撑。前列腺癌经过治疗后，CTC计数数目的变化，可以很好的对抗肿瘤药物进行疗效评估和预后的评估，实现精准治疗、避免医疗资源的浪费。尽管CTC的检测目前仍受限于检测技术，并且在我国前列腺癌中更深入广泛的研究仍然欠缺，需要更多样本、前瞻性的研究来证明其检测的价值，但随着相关研究的不断深入和成熟，CTC将会被以更有效的方式应用于临床，并最终造福于患者。