HPV蛋白、miRNAs和外泌体在宫颈癌炎症作用中的研究进展

曹 宁 夏百荣 综述 娄 阁 审校

2018年，全球约有57万人确诊宫颈癌，约31.1万人死于该病[1]。约有95%的宫颈癌患者感染人乳头瘤状病毒(Human papilloma virus，HPV)，大部分HPV会自行清除，而某些HPV株的持续感染可能会导致宫颈瘤变[2]。目前，宫颈慢性炎症与HPV诱导的宫颈癌之间的联系仍存在争议。大量研究数据表明，miRNAs在调节细胞周期、凋亡、转移和耐药等方面发挥重要作用[3]。在宫颈癌的发展过程中部分miRNAs发生失调，这些失调的miRNAs可调节炎症因子并诱导宫颈癌发生发展[4]。外泌体是大小约30～150 nm的囊泡，能够将核酸、蛋白质和脂质从供体细胞转移到受体细胞的载体[5]。外泌体在神经退行性疾病、败血症、关节炎、炎症性肠病和动脉粥样硬化中的作用中均提示外泌体可能参与了炎性疾病的发展。

1 炎症因子参与宫颈癌的发生发展

炎症是一种保护机制，可分为急性炎症和慢性炎症。在外界不良因素持续作用下，急性炎症会变成慢性炎症，有证据表明慢性炎症与肿瘤密切相关[6-7]。炎症通路的过度激活在肿瘤发生中起重要作用，可促进低级别病变进展为高级别病变，甚至是浸润性宫颈癌[8]。

血管内皮生长因子(Epidermal growth factor receptor，EGFR)与其他信号通路之间具有广泛的联系，这些通路参与了生长因子、细胞因子和炎症介质的释放。因此在宫颈癌患者中，EGFR过表达与炎症诱导及肿瘤不良预后有关[9]。现发现超过33种细胞因子的失调与宫颈癌前病变的发生有关。细胞因子的过度表达与肿瘤生长相关，例如IL-6激活信号转导和转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，参与宫颈癌的慢性炎症。STAT3信号异常促进肿瘤细胞生长、侵袭和转移，它的持续激活被认为是宫颈癌预后不良的一个标志[10]。在氧化应激条件下，细胞周期和凋亡调节因子2(Cell cycle and apoptosis regulator 2，CCAR2)可导致IL-8表达升高，其与宫颈癌发生发展有关[11]。在肿瘤发展的早期阶段，不同的细胞因子，例如IL-1、TNF-α、TGF-β、IFN-α可抑制HPV复制，进而抑制肿瘤进展。综上所述，这些证据提示慢性炎症及炎性介质在宫颈癌进展中具有促进作用。因此，寻找更多的肿瘤标志物来全面了解宫颈癌相关炎症的类型及作用机制，进而开展新的免疫治疗势在必行。

2 HPV蛋白在宫颈癌炎症中的作用

HPV感染引起的慢性炎症是宫颈癌发生的潜在因素。这是一个复杂的过程，包括活性氧和活性氮、细胞因子、趋化因子、生长和细胞存活因子、环氧合酶(Cyclooxygenase，COX)和金属蛋白酶、前列腺素和特定类型的miRNAs。这些介质可引起肿瘤细胞增殖，并引起DNA的突变和甲基化，刺激血管生成，促进HPV诱导的宫颈癌发展。

Prabhavathy等[12]研究报道，HPV感染的细胞表现出NF-κB和STAT3的活化作用。HPV16感染的宫颈组织中，NF-κB和STAT3靶基因的表达增加，HPV16 E2蛋白与之共同调节细胞炎症反应。此外，HPV16 E2增强了HEK 293细胞中炎性介质IL-1β和SDF-1α诱导的NF-κB活化。这些结果揭示了E2在调节NF-κB和STAT3活性方面的新作用，这可能在宫颈基质炎症条件下对HPV16感染的细胞致癌进程有影响。在HPV介导的宫颈癌发生过程中，HPV蛋白与炎症通路的相互作用已成为众多研究的重点。IL-6的高表达与细胞衰老和致癌有关。Ren等[13]的研究表明，HPV-16/18 E6蛋白通过IL-6和STAT3信号通路促进成纤维细胞衰老。宫颈上皮细胞感染HPV-16/18可通过IL-6/STAT3调控的旁分泌和自分泌信号通路刺激成纤维细胞衰老。这种微环境的改变可导致宫颈上皮内瘤变Ⅰ～Ⅱ(CINI-Ⅱ)，并逐步发展为CIN Ⅲ，在长时间的潜伏期后最终发展为宫颈癌。IL-10的表达与HPV感染相关宫颈病变的分级直接相关。由宫颈上皮细胞产生的IL-10，可调节宫颈粘膜的细胞免疫和炎症反应。Torres等[14]报道HPV E2蛋白可与IL-10基因的调控区域结合，增强启动子活性。

3 microRNAs对宫颈癌相关炎症因子的调节

自1993年首次发现miRNAs以来，这些短链非编码RNA寡核苷酸(长度约为22个核苷酸)已被证明是动物、植物和人类DNA转录后基因表达的关键调控元件。据预测，约60%的人类基因组由miRNAs调控，同时已有研究表明miRNAs在宫颈癌中具有高变异性[15]。

Fan等[16]发现miR-429下调导致IKKβ/NF-κB途径激活及IL-6和IFN-β的产生，并因此增强炎症反应和促进肿瘤进展。HMGB1是一种致癌基因，可诱导宫颈癌的炎症反应，促进肿瘤的发生和转移。miR-34a、miR-1284和miR-142与HMBG1表达呈负相关[17-18]。HMGB1可下调miR-1284(宫颈癌中的抑癌基因)，增加宫颈癌细胞对顺铂的耐药性。HMGB1在宫颈癌患者的淋巴转移中起重要作用，已经证实下调miR-142可增加宫颈癌患者的淋巴转移率。miR-125a为肿瘤抑制因子，STAT3是miR-125a新的靶点。STAT3的表达与miR-125a在宫颈癌中的表达呈负相关，本研究强调了miR-125a在宫颈癌细胞增殖和进展中的重要性，并表明miR-125a可能是宫颈癌的一个有用的治疗靶点。STAT3在宫颈癌中也是miR-125b的靶基因。有人认为miR-125b是lnc-SNHG12的靶点，与lnc-SNHG12呈负相关。由于STAT3在诱导炎症和增殖中的作用，上调lnc-SNHG12可间接导致STAT3活化进而增强HeLa和SiHa细胞的增殖和侵袭能力[19]。在宫颈癌中，一些miRNAs表达不足，而另一些则过度表达，这意味着miRNAs既可以作为抑癌基因，也可以作为癌基因。我们对宫颈癌中miRNAs调控的了解最近有所增加，对其在炎症中作用的进一步研究可能为发现宫颈癌的治疗方法提供新的机会。

4 外泌体在宫颈癌进展中的作用

现如今，研究人员面临的重要任务是识别外泌体的分子成分，并了解其在炎症、免疫反应调节和血管生成中的直接或间接作用。有研究对外泌体进行检测，在外泌体中发现了凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein，IAPs)，包括XIAP、c-IAP1、c-IAP2和livin/MLIAP[20]。未表达E6和E7蛋白的HeLa细胞中的外泌体含有较少的IAPs，从而得知IAPs的存在依赖于HPV癌蛋白。另一项研究显示Hela细胞系来源的Survivin阳性外泌体中，共有52个不同的miRNAs被下调，E6/E7的沉默影响了其中23个miRNAs的表达。上调的miRNAs具有抗凋亡、促增殖和抗衰老的作用，而下调的miRNAs功能与之相反[21]。Chiantore等[22]对来自于原始角质形成细胞外泌体中的miRNAs进行了检测，发现HPV E6或E7癌蛋白高表达可诱导某些miRNAs的失调。HPV癌基因以及HPV衍生的miRNAs可以通过外泌体的产生增强肿瘤细胞微环境的病毒致癌作用。其他研究已经证明在Hela细胞系来源的外泌体中存在长链非编码RNA(lncRNAs)，特别是lncRNA-p21、CCNDA1-lncRNA、HOTAIR、TUG1和GAS5。其中lncRNA-p21(p53依赖转录的抑制因子)是外泌体中比亲本细胞表达还要高的lncRNA。研究表明外泌体在肿瘤的炎性微环境中起着关键的作用[23]。HPV感染细胞的外泌体可以在细胞间水平转移mRNA、miRNA和细胞因子，因此，外泌体可能在宫颈癌微环境中起免疫调节作用。此外，促炎细胞因子IL-36γ能通过Wnt信号通路诱导角质细胞的炎症反应[24-25]。

5 利用miRNAs和外泌体治疗HPV阳性宫颈癌

因为miRNAs可以作为HPV特异性的生物标志物，还有可能进一步开展个性化治疗方法和新的靶向治疗，所以确定与不同类型HPV感染的癌症有关的miRNAs种类至关重要。我们对HPV阳性肿瘤中miRNAs失调及其影响各自靶基因的机制有了越来越多的了解。但是迄今为止，仅提出了几种抑制肿瘤转移的miRNAs(如miR-34a、miR-143/145和miR-93)可有望作为治疗方案，但是这些miRNAs未能成功开展治疗。与传统的基因治疗一样，miRNAs类似物的传递需要一个有效的载体系统来传递预期的基因。

外泌体作为小分子药物和大型生物药物的运载工具，被越来越多的学者研究。外泌体具有稳定性、生物相容性、低免疫原性和体外装载能力等优点。最近，研究人员探索了用于传递siRNAs、miRNAs、shRNAs和抗炎或抗癌药物(姜黄素、紫杉醇或阿霉素)的外泌体。在小鼠模型中的研究表明，具有HPV特异性活动的外泌体可能有助于宫颈癌免疫治疗[26]。这种重组外泌体可用于开发治疗性疫苗，但其生产过程较为复杂。Nefmut是HIV-1负调节因子突变体，Nefmut已被用于提供识别HPV-E6和HPV-E7癌蛋白的细胞内抗体。现已在体外和体内使用Nefmut-E7或Nefmut-E6 DNA质粒实现了外泌体中Nefmut的表达。这些发现对于HPV-16治疗性疫苗的研究具有重要的参考意义[27]。虽然这些发现具有一定的研究前景，但需要改进标准化技术来纯化外泌体，并检测外泌体内容物使其更广泛地应用于临床治疗。

6 小结与展望

已知持续感染高危型HPV是宫颈癌的一个重要病因，然而近年来我们得知慢性炎症为宫颈癌发生的另一个重要因素。各类炎症介质的共同作用促进了细胞的增殖、死亡、衰老以及基因突变和血管生成。在宫颈炎症中，E6/E7蛋白的表达水平明显升高，因此猜测宫颈炎症可能在HPV致癌过程中发挥重要作用。目前miRNAs对炎性微环境和宫颈癌的致病作用机制尚不清楚，需要进一步的研究来阐明。多项研究发现外泌体在几种炎性疾病的发生、发展和治疗中发挥着重要的作用，外泌体可能成为疾病诊断和预测预后的生物标志物。考虑到外泌体的多功能作用，需要进一步研究分析宫颈癌中的外泌体内容物，了解外泌体是如何介导宫颈癌炎症过程的。