药物性肝损伤发病机制研究进展

郭荣荣 张缭云

1.山西医科大学 (山西 太原，030001) 2.山西医科大学第一医院

药物性肝损伤(DILI)是一类复杂疾病，根据其病理特征分为肝细胞损伤型、胆汁淤积型、混合型和肝血管损伤型，临床中最常见的是肝细胞损伤型[1]。DILI可分为固有型肝损害和特异质型肝损害，其中药物固有型肝损害主要为剂量依赖性，由于药物或其代谢物的直接毒性导致肝损伤，并且具有较短的潜伏期，在动物模型中是可重复的，具有可预测性，例如对乙酰氨基酚(APAP)过量。然而，绝大多数DILI是特异性的或不可预测的，并且在大多数情况下，常规动物模型药理学及毒理学无法确定后续临床毒性的风险[2]。DILI的发病机制是多种因素相互作用的结果，这些因素盘根错节，已经成为近年来研究的热门话题，但其损伤机制目前尚未完全阐明，本文就近几年DILI的直接肝损伤机制、特异质性肝损伤机制、线粒体功能损伤、遗传等方面进行综述。

1 药物的直接肝损伤机制

药物通过自由基或代谢介质使细胞膜脂质过氧化，损伤肝线粒体导致肝细胞损伤；也可通过改变细胞膜或细胞内分子结构，激活凋亡途径等。Kaplowitz[3]对DILI的发病机制提出了特异性“上游”事件和非特异性“下游”事件的假说。“上游”事件：药物或其代谢产物对肝脏的直接损伤；“下游”事件：肝细胞内不同损伤与保护通路之间的失衡。Russmann等[4]将DILI的过程概括为三个步骤：药物或其代谢产物直接损伤引起肝细胞应激反应，导致自身免疫反应；线粒体膜通透性改变；线粒体膜通透性改变使三磷酸腺苷合成减少，最终导致肝脏细胞的坏死或凋亡。

肝脏中药物的代谢可分为两相。第Ⅰ相代谢主要是亲脂性药物通过细胞色素P450酶(CYP)氧化、还原和水解等反应形成一系列极性基团；第Ⅱ相代谢也是主要通过CYP450代谢产生亲水性且更容易被清除的代谢产物。药物诱导肝损伤的发病机制通常涉及有毒药物或其代谢物的参与，多与剂量相关，具有潜伏期短的特点。然而，在使用呋喃妥因、磺胺类药物(例如红霉素和阿莫西林-克拉维酸盐)等药物或甚至停药后药物经过非常长的潜伏期后才出现免疫反应时，会出现例外情况。在发生DILI的药物中，对APAP的剂量依赖性和其自身的肝毒性是DILI发生的最常见原因，是可预测的。APAP主要由肝脏代谢，其主要代谢产物是葡萄糖醛酸苷或硫酸盐结合物，经转运体转运出肝脏，由胆汁或肾脏排泄。而少量APAP通过CYP450酶(主要是CYP2E1)在肝脏中转化为毒性亲电子芳基化代谢物N-乙酰基-对苯醌亚胺(NAPQI)，该毒性代谢产物经谷胱甘肽S转移酶(GST)解毒。长期过量的APAP使葡萄糖醛酸化和硫酸化途径饱和，过多的NAPQI会耗尽GST满足其代谢，并且与蛋白巯基共价结合形成蛋白加合物，造成氧化应激和线粒体功能障碍，引起急性肝小叶中心坏死[5]。参与APAP代谢的代谢酶中，CYP3A4也必不可少，有研究表明，增加CYP3A4酶的活性可能使APAP的毒性作用更加显著。相反，当CYP3A4酶的活性受到抑制时，因APAP过量引起的肝毒性可显著降低。这种可预测的APAP毒性过程使得N-乙酰半胱氨酸仍然是今天APAP过量首选的治疗药物。

2 药物的特异质性肝损伤机制

尽管在临床药物开发之前，在体外测试系统和各种动物模型中进行了广泛的安全性测试，但是该测试经常无法识别潜在的肝毒性药物。广义上，药物的特异质性肝损伤机制可分为两类：超敏反应型(也称免疫特异质性肝损伤)和代谢特异质性肝损伤。

2.1 免疫特异质性肝损伤 免疫特异质性肝损伤患者可出现发热、嗜酸粒细胞增多、皮疹、自身抗体阳性和史蒂文斯-约翰逊综合征。非免疫反应较少出现上述特征，并且免疫介导的DILI具有较长的潜伏期。

2.1.1 肝脏的固有免疫 常见的固有免疫细胞包括单核巨噬细胞、树突细胞和自然杀伤T(NKT)细胞等，当发生DILI时，受损伤的肝细胞周围可见大量的巨噬细胞浸润，同时可以观察到骨髓中前体巨噬细胞增殖[6]。高迁移率族蛋白B1是一种细胞损伤相关模式，当肝脏细胞发生凋亡或坏死时可以被释放，细胞损伤相关模式还可诱导中性粒细胞浸润。肝脏含有丰富的淋巴细胞，从肝脏分离的自然杀伤(NK)细胞可能对各种细胞诱导细胞毒性，而NKT细胞一般要求在白细胞介素(IL)-2的存在才能发挥效应。有研究表明，发生DILI时，NK细胞可促进中性粒细胞的募集，同时NK细胞也可以分泌IL-17，IL-17有不同的免疫调节作用[7]。然而，其他研究表明，由α-半乳糖神经酰胺诱导的肝细胞损伤，NKT细胞被特异性激活，并产生大量IL-17，其抑制了炎症的发展[8]。这两种不同的观点，需要我们进一步研究NK/NKT在肝脏先天免疫中的作用。

2.1.2 肝脏的适应性免疫 适应性免疫反应可能是DILI发生的最后共同事件。由于药物或药物的活性代谢产物与肝细胞内共价蛋白结合，形成药物-蛋白质加合物，被识别为抗原而激活外周血淋巴细胞，引起抗体形成或T细胞介导的细胞裂解，诱导免疫介导的反应或直接肝毒性，而发生超敏反应，占所有特异质性DILI病例的23%～37%。此外，由于血液循环使得肝细胞对药物的摄入增加，形成更多的活性代谢物，从而增加了发生DILI的风险。目前已经提出了一些不同的假设来解释DILI适应性免疫激活模式，如半抗原理论假说、 P-i 理论假说和改变肽库谱假说。

半抗原理论假说：药物的代谢产物在肝细胞中经过共价结合形成药物-蛋白质复合物，这些复合物被抗原呈递细胞呈递给人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ分子，然后与CD4+T细胞受体相互作用，激活下游的细胞毒性CD8+T细胞和B细胞[9]。然后由细胞质细胞产生大量针对抗原的特异性抗体。如麻醉吸入剂氟烷，一些抗惊厥药如苯妥英，以及某些抗生素如甲氧苄啶、磺胺甲噁唑、头孢唑啉和环丙沙星[10]。这些药物与肝脏蛋白质如细胞色素P450酶共价结合，作为半抗原-抗原加合物呈递给MHCⅡ类分子，从而引发激活CD8+T细胞的免疫应答。T细胞反过来表达Fas配体和肿瘤坏死因子，它通过在肝细胞表面大量表达的死亡受体介导肝细胞死亡[11]。导致免疫激活的易感HLA多态性本身并不能完全解释肝毒性，因为大多数鉴定的与毒性相关的HLA单倍型在一般人群中非常常见，而特异质性DILI 是罕见的事件。因此，并非所有具有易感HLA基因多态性的个体在暴露于药物时都表现出特异质性DILI，这可能与肝脏固有的免疫状态和调节免疫耐受有关[10]。

P-i假说即药理学相互作用：一些药物可以直接与主要组织相容性复合物分子相互结合，以激活免疫系统。如利多卡因、塞来昔布、卡马西平、希美加曲，不需要共价结合蛋白质形成新抗原就能刺激并致敏T淋巴细胞。相关研究已证实，希美加曲直接抑制肽可与HLA DRB1*0701结合，支持药物与该HLA结合位点的直接相互作用[12]。

改变肽库谱假说：某些药物可能使内源性肽错配到HLA，导致自身免疫。阿巴卡韦皮疹和史蒂文斯-约翰逊综合征[13]可解释这一假说。阿巴卡韦与HLA-B*57:01非共价结合，改变抗原裂缝的形状和化学结构，随后呈递给T细胞，驱动CD8+T细胞活化，最后表现出超敏反应综合征。

部分DILI还有其他假设，如多重决定因素相互作用假说，该假说指出多种危险因素(如多态性、年龄、性别、既往病症)可能重叠在一起诱导DILI[14]。

2.2 代谢特异质性肝损伤 代谢特异质性肝损伤与药物代谢酶相关性更大，其中CYP450酶是主要的药物代谢酶。药物代谢酶的遗传多态性，常使CYP450酶系统代谢能力低下，药物或其中间代谢产物积累而导致DILI发生，特征为具有较长潜伏期，无过敏症状。研究发现，异烟肼可显著提高CYP2E1酶的敏感性，导致肝损伤的危险提高3～4倍。后来又发现参与药物代谢的Ⅱ相代谢酶GST也存在遗传多态性，GST可结合氧化修饰产物，降低细胞毒性。研究报道，GSTM1和GSTT1基因缺失可导致药物代谢酶活性降低甚至不发挥其本身的作用。在GSTM1和GSTT1基因缺失的患者中，DILI的发生率增加[15]。而有研究却显示GSTM1和GSTT1缺失基因型与肝毒性均无显著相关性[16]，因此可见，GST基因型在抗结核药物所致DILI中的作用仍有待进一步研究。

3 线粒体功能损伤

由药物所致的线粒体功能损伤常常是多种机制作用的结果。线粒体为细胞生命提供直接能量并维持肝细胞中的环境平衡,也是氧化应激损伤的重要目标细胞器。活性代谢产物的广泛生产是肝损伤的关键步骤[17],如CYP 450酶代谢产生的新电子基和自由基，会影响酶的活性并且能攻击、破坏细胞膜和细胞器膜及膜受体，从而使肝细胞受损。APAP摄入体内后，APAP中间代谢产物NAPQI和线粒体衍生的活性氧损伤线粒体DNA,并激活c-Jun N末端激酶信号通路，线粒体衍生的活性氧扩增导致线粒体膜通透性增加，使体内超氧化物水平增高，钙稳态改变，减少ATP的合成，增加NF-κB p65的活化和促炎因子肿瘤坏死因子-α基因的表达，最终导致肝细胞坏死[18]。异烟肼诱导的DILI中，异烟肼在CYP2E1的催化下生成毒性代谢产物乙酰肼和肼从而损伤肝细胞，乙酰肼与肝细胞内的生物大分子共价结合，继续水解可成为具有肝毒性的肼，导致肝内的GSH耗竭而引起线粒体膜通透性改变，损伤肝细胞[19]。也有可能产生共价药物-蛋白质加合物，形成半抗原而激活免疫应答。当然也可以由于异烟肼或其代谢物直接引起线粒体损伤，这均会导致线粒体发生氧化应激反应和能量稳态失去平衡[14]。若当前线粒体已经存在这种缺陷，即使是异烟肼尚未到达刺激机体肝细胞破坏的浓度，也可能由于复合物功能的潜在损害，而导致显著的肝细胞损伤。相关研究已经表明，线粒体损伤的其他机制还包括：在线粒体进行的β-氧化受损，线粒体呼吸链受损，线粒体膜破坏和线粒体DNA损伤，分别由他莫昔芬、丙戊酸、双氯芬酸和他克林引起[20]。另外，由于药物或其代谢产物与胆管细胞中的转运蛋白结合，影响胆管细胞内胆汁酸的正常分泌，导致胆汁排出受阻，胆汁淤积，大量的胆汁酸盐造成肝细胞、胆管细胞的间接损伤[21]。

因此，药物的直接肝毒性对线粒体的损伤涉及结构变化和功能紊乱等多种机制。任何一种药物对线粒体的损伤都是多途径相互作用，包括线粒体DNA的复制和表达受到抑制、内膜通透性增加、电子传递体系的抑制和新陈代谢的抑制等，是一个复杂的过程。

4 遗传因素

以前的遗传关联研究主要集中在参与药物摄取、代谢、转运或解毒的候选基因中，可用于预测药物药代动力学和药效学参数。例如，N-乙酰基转移酶2基因活性降低和CYP2E1介导的氧化代谢活性增加与异烟肼肝毒性有关。然而，这些关联常常在独立队列研究中不能复制。识别遗传关联的另一种方法是在没有特定预先假设的情况下收集DILI病例和群体对照中的整个人类基因组。在DILI中首次成功进行的GWA研究发现，氟氯西林诱导的肝损伤与6号染色体上的HLA-B*5701等位基因之间存在非常强的关联，氟氯西林相关的胆汁淤积性肝炎患者中，HLA-B* 5701携带率比普通人群高3倍,而HLA-B* 5701可使患者发生氟氯西林肝损伤的风险至少增加80倍[22]。氟氯西林在欧洲国家被广泛使用，在开始治疗的45 d内仅有小于1%的患者发生胆汁淤积型肝损伤，但是导致肝损伤易感性增加的确切机制还需进一步探索。研究表明，HLA-DRB1*1501-DQB1* 0602与阿莫西林-克拉维酸和氟烷等药物引起的药物性胆汁淤积强相关[23]，而HLA-A * 3002 和B*1801则与阿莫西林-克拉维酸引起的肝细胞损伤型DILI密切相关[24]。此外，由于HLA多态性在种族上受到限制，在一个患者群体中缺乏DILI易感性的遗传关联并不排除另一组中的正相关，如HLA易感性等位基因在汉族和欧洲人对卡马西平过敏反应不同。在未来5～10年中，将使用基因测序完成对特异质性DILI易感性的宿主遗传多态性的研究。

越来越多的证据显示，DILI的发病机制复杂，是上述要素互相作用的结果，而且各机制之间互为因果。如细胞应激和线粒体损伤可用作触发免疫反应的危险因素，先天性免疫参与启动适应性免疫应答，各种损伤机制互相关联，最终都导致线粒体损伤。目前了解到的DILI发病机制只是九牛一毛，预防和治疗DILI还需要深入了解肝毒性机制。我们需要从免疫学和分子生物学角度更深入地研究DILI发病靶点。相信在不久的将来，能降低DILI的发病水平，可以找到预防、诊断和治疗DILI的方法。