油茶肉质果多糖诱导糖尿病小鼠肝细胞生产胰岛素的实验研究

李加林，张嘉文，丁小丽，林建梭，吴素珍

（1.赣南医学院中药学教研室；2.赣南医学院2019级硕士研究生；3.赣南医学院2016级中药学专业本科生；4.赣南医学院2014级生物技术专业本科生；5.赣南医学院生物化学与分子生物学教研室，江西 赣州 341000）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种严重的慢性代谢紊乱性疾病，已经成为继心血管疾病和癌症之后的第三大致死性疾病。糖尿病的发病率在全球范围内呈逐渐上升的趋势，据世界卫生组织报道，全世界约有3.47 亿人患有糖尿病，其中90%～95%的患者为2 型糖尿病［1-3］。到目前为止，很多糖尿病的治疗方法并不是十分有效，如口服促胰岛素分泌剂和胰岛素增敏剂或高剂量的应用胰岛素会产生不良反应，如低血糖、肝脏损伤、乳酸中毒、腹泻、充血、慢性心脏衰竭和体重增加等。这些药物虽然能使糖尿病患者的血糖维持在接近正常水平，从一定程度上减轻糖尿病产生的代谢综合征，但是却不能达到根治的目的，糖尿病患者需要终生服药以控制血糖，给家庭和社会带来了沉重的经济负担。胰腺移植是治疗糖尿病的重要途径，但供体来源短缺和免疫排斥问题限制了其广泛应用［4-5］。

近年来人们发现，一些干细胞和成体细胞在体外可诱导分化或转分化为胰岛素分泌细胞。如骨髓源性间充质干细胞、胰腺源性干细胞、成体干细胞甚至成体细胞均可转分化为胰岛素分泌细胞［6-9］，为糖尿病的治疗开拓了新的思路，其中最引人注目的是来源于肝脏的细胞，这是因为肝脏和胰腺在发育上具有同源性，均起源于前肠内胚层。但是，当前大多数肝源性细胞向胰岛素分泌细胞的转化还存在一些问题，如体外诱导肝源性细胞向胰岛素分泌细胞分化的比率较低，而细胞移植后还有致畸致瘤的风险，同时还可能产生少量的胰腺外分泌细胞，还有诱导分化而来的肝源性胰腺细胞改善糖尿病模型小鼠的高糖症状的维持时间有限等，致使细胞移植的临床应用也不容乐观。如果能够找到一种直接诱导糖尿病患者自身的肝细胞分化为胰岛素分泌细胞且无毒副作用的药物，那么就无需在体外经过漫长的质粒载体的构建、转染、诱导分化，再进行体内移植的过程就能直接在体内诱导肝细胞分化为胰岛β 细胞，这不仅可以解决糖尿病细胞治疗的细胞来源问题，而且也不存在细胞移植后的免疫排斥问题了。

有很多研究表明，中草药及其有效成分能够发挥抗糖尿病作用且毒副作用更小［10］。油茶（Camellia oleiferaAbel）为常绿小乔木或灌木，是我国特有的木本食用油料树种，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物，尤其在我国江西省南部分布较多［11］。油茶肉质果是由一类外担菌（ExobasidiumvexansMassee）侵染油茶后使油茶果膨大、变成空心后引起的，在我国民间可作为野生水果直接食用，仅在每年的清明节前后，油茶树梢才会长出这种与油茶果不同的空心肉质果（俗称茶苞）。文献研究表明油茶肉质果提取物能够明显的降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血糖，与传统中西医结合降血糖药物消渴丸的降血糖效果相当。然而，油茶肉质果毕竟是被真菌感染后引起的，而且很多种植者认为其会毁坏庄稼，所以即使具有很高的营养价值，人们还是对它有担忧。因此，有学者对油茶肉质果的食用安全性进行了评价，通过急性毒性试验、小鼠微核试验、小鼠精子致畸实验，综合评估得出油茶肉质果属于无毒类物质的结论，可以作为野生水果食用［12］。本实验首次发现油茶肉质果多糖能够诱导糖尿病小鼠肝细胞分泌胰岛素，且能使糖尿病小鼠肝脏中转录因子胰十二指肠同源盒基因（PDX-1）的蛋白表达上调，这将会为开发利用油茶副产品——油茶肉质果提供新的实验依据，为进一步拓宽对油茶的开发和利用奠定前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 油茶肉质果的采集油茶肉质果于2016 年清明节前后采集于江西省吉安市，并由赣南医学院李加林副教授鉴定为油茶（Camellia oleiferaAbel）肉质果。

1.1.2 油茶肉质果多糖的制备将样品清洗并在65 ℃下干燥，然后切成小块，再用高速粉碎机将其磨成细粉。之后，将粉末通过40 目的筛子，并在4 ℃下储存直至使用。将研磨后的物料在室温下浸入蒸馏水中过夜，然后在（99±1）℃下萃取2 h。离心提取物，收集上清液并在70 ℃减压浓缩。用3 倍体积的乙醇沉淀该溶液，并通过过滤收集沉淀物，并将其重新溶解在蒸馏水中。用Sevage 法去除蛋白质后，将多糖溶液用蒸馏水充分透析并冷冻干燥，参考LU 等的研究方法［13］，确定提取物中多糖的含量为40.3%，然后将多糖在－20 ℃下保存用于动物实验。

1.1.3 实验动物SPF 级C57BL/6 小鼠，雄性，体重（22±2）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002。

1.1.4 主要试剂STZ购自Sigma公司，鼠抗β-actin一抗（Santa Cruz），兔抗Insulin 一抗（Proteintech），鼠抗Glucagon 一抗（Proteintech），兔抗PDX-1 一 抗（Proteintech），辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG（Santa Cruz），FITC 标记的羊抗鼠IgG（武汉博士德），Rhodamine 标记的羊抗兔IgG（武汉博士德），DAPI购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病动物模型的建立C57BL/6 小鼠适应环境喂养1周后，采用高糖高脂饲料喂养8周，禁食12 h（禁食不禁水）后连续5 d腹腔注射100 mg·kg-1STZ（溶于pH4.2～4.5 的柠檬酸钠缓冲液）。在最后一次注射STZ 后2 周后测随机血糖。血糖≥16.7 mmol·L-1的小鼠被认为是糖尿病小鼠，并被选为研究对象，正常对照组腹腔注射等体积柠檬酸钠缓冲液。随后将造模成功的小鼠分为糖尿病组（灌胃生理盐水），油茶肉质果多糖组（25 mg 油茶肉质果多糖溶解在1 mL生理盐水中，每10 g体重的小鼠灌胃0.1 mL药物，即给药量为250 mg·kg-1油茶肉质果多糖），在3个月后，取小鼠肝脏，一部分用中性甲醛固定用于免疫荧光实验，一部分新鲜肝脏组织冻存于液氮中用于Western Blot实验。

1.2.2 免疫荧光小鼠肝脏组织经中性甲醛固定、石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBS 漂洗3 次；2%BSA 37 ℃湿盒内封闭30 min；滴加适当稀释的特异性抗体，放在湿盒中，37 ℃孵育30 min，0.01M PBS漂洗3次；加FITC、Rhodamine 标记的荧光二抗37 ℃避光孵育30 min，0.01M PBS 避光漂洗3次；DAPI染核，37 ℃孵育5～10 min，PBS 漂洗3 次；抗荧光淬灭剂封片后于荧光显微镜下观察。

1.2.3 Western Blot采用 SDS-PAGE（SDSpolyacrylamide gel electrophoresis）分离样品中的蛋白成分。再将凝胶上的蛋白转印到0.45µm硝酸纤维素膜（NC膜）上，NC膜先进行封闭，与各自不同浓度的一抗进行孵育4 ℃过夜，洗涤后再与过氧化物酶标记的二抗室温孵育，再次洗涤，电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）检测免疫印迹信号，并使用Bio-Rad Chemi-Doc MP 成像系统记录蛋白条带。用Image J软件分析灰度值。

1.2.4 统计方法用SPSS 20.0 统计软件进行方差分析，多个样本均数与对照组样本均数之间的比较采用单因素方差分析。结果表示为平均值±标准差。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化实验检测肝脏中胰岛素的表达图1 免疫组化结果显示，糖尿病小鼠灌胃250 mg·kg-1油茶肉质果多糖3 个月后，在其肝脏某些细胞的细胞核周围显示棕色（如图1 中红色箭头所示），由此推测油茶肉质果多糖可诱导糖尿病小鼠肝脏细胞分化为胰岛素分泌细胞。

图1 免疫组化实验检测肝脏中胰岛素的表达

2.2 免疫荧光检测油茶肉质果多糖诱导糖尿病小鼠肝脏细胞分化为胰岛素分泌细胞如图2免疫荧光结果所示，采用250 mg·kg-1油茶肉质果多糖灌胃糖尿病小鼠3 个月后，其肝脏组织细胞中可见胰岛素表达（红光），且胰岛素均围绕细胞核（蓝光）分布，该结果进一步说明油茶肉质果多糖可诱导糖尿病小鼠肝脏细胞分化为胰岛素分泌细胞，如图2 中白色箭头所示。

2.3 油茶肉质果多糖诱导糖尿病小鼠肝脏PDX-1的蛋白表达水平上调在肝源性细胞向胰腺细胞转分化过程中，转录因子胰十二指肠同源盒基因（PDX-1）是关键的调控基因之一。进一步的研究发现灌胃油茶肉质果多糖的糖尿病小鼠其肝脏PDX-1的蛋白表达水平与糖尿病组比明显升高，如图3 所示，这进一步说明了油茶肉质果多糖可以诱导糖尿病小鼠肝细胞向胰岛素分泌细胞分化。

图2 免疫荧光双标检测肝脏中胰岛素和胰高血糖素的表达情况

图3 Western Blot 分析小鼠肝脏中PDX-1的蛋白表达情况

3 讨论

糖尿病时长期伴随高血糖不仅使糖尿病患者常会发生全身性的脏器组织损害，还会损伤胰岛β细胞，产生胰岛β 细胞功能障碍从而使胰岛素的分泌受损［14-15］。胰岛素是体内唯一降低血糖的激素，而胰岛β 细胞是唯一负责转运、合成和释放胰岛素的细胞，糖尿病时通常出现胰岛β细胞损伤，从而影响胰岛素的分泌和血糖控制［16-17］。因此，长期以来人们一直致力于增加胰岛β 细胞数量，修复胰岛β细胞功能来治疗糖尿病，但是能够分裂的β 细胞比例极少（仅占1%），因此仅通过刺激现有的胰岛β细胞分裂来增加胰岛素的分泌似乎也不太可能。近年来人们发现，一些干细胞和成体细胞在体外可被诱导分化或转分化为胰岛素分泌细胞，为糖尿病的治疗开拓了新的思路。

通过免疫荧光和免疫组化实验首次发现，油茶肉质果多糖能够诱导糖尿病小鼠肝细胞生产胰岛素。在肝源性细胞向胰腺细胞转分化过程中，转录因子胰十二指肠同源盒基因（PDX-1）是关键的调控基因之一［18］。有研究表明，通过导入PDX-1 基因，能够使成熟的肝细胞或具有分化潜能的胎肝细胞分化成胰腺细胞，有学者通过克隆人、小鼠、大鼠的PDX-1 基因编码区序列，构建PDX-1 真核细胞表达载体，转染小鼠胎肝基质细胞后发现其可诱导肝实质向具有胰腺功能的细胞分化，这提示PDX-1基因在胰腺组织发育过程中具有非常重要的作用。进一步的研究表明，油茶肉质果多糖可以诱导糖尿病小鼠肝脏中PDX-1 的蛋白表达水平上调，这可能是油茶肉质果多糖诱导糖尿病小鼠肝细胞向胰岛素分泌细胞转化的原因。

据文献报道，我国产生肉质果的油茶树为25%～50%，最高可达60%～70%［19-21］。然而，由于不了解其营养价值和药用价值，致使这种可食用的资源没有列入野生果的行列，更没有得到开发和利用，在我国大部分地区，每年清明节后这种果实便自然脱落，“无人问津”。本实验为合理开发利用油茶副产品——油茶肉质果提供了实验基础，开拓了新思路，将为当地经济发展带来曙光。但本实验所提取的油茶肉质果多糖为粗提物，成分较复杂，在后期的实验中，需要进一步探讨油茶肉质果粗多糖中发挥作用的具体成分。