基于网络药理学探讨清瘟解热合剂治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制*

朱波宇，杨 璐，王洪武，张翟轶，李 钦，崔换天，廖家抱，温伟波△

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.云南省中医医院，云南 昆明 650021；3.山东大学生命科学学院/山东省动物细胞与发育生物学重点实验室，山东 青岛 266237；4.嘉兴市中医医院，浙江 嘉兴 314033）

今年初，湖北省武汉市出现了由新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）。COVID-19 具有传播迅速广泛、传染性强、各类人群普遍易感的特点，目前临床尚无特效药[1]。中医药作为我国的传统医药，在纳入新型冠状病毒肺炎诊治方案后，取得了突出的疗效。COVID-19在我国传统医学里属于“疫病”的范畴，多为外邪侵入机体，体内正气不足导致。运用中医理论进行辨证，病因为感受疫戾之气，病位在肺，基本病机特点为“湿、热、毒、瘀”[2-3]。

清瘟解热合剂（Qingwen Jiere Mixture）是立足于中医对“瘟疫”的防治理论而研制的中药复方制剂。主要成分有：藿香、柴胡、黄芩、连翘、法半夏、草果、茵陈、马蹄香、滑石、甘草、白薇、炒神曲、炒厚朴。藿香具有芳香化湿、和胃止呕的功效；柴胡可以疏散退热、升举阳气；黄芩和连翘能清热、泻火解毒；半夏可燥湿化痰、降逆止咳、消痞散结；草果能燥湿温中、截疟祛痰；茵陈可清利湿热，利胆退黄；马蹄香内服消风散气解暑，利尿通淋去积；滑石为寒凉药物，能清热解暑，保护肠壁；甘草具有补脾益气、清热解毒和调和诸药的功效，在驱邪的同时又扶助正气；白薇能清热凉、利尿通淋；厚朴归肺经、脾经，可以燥湿行气、消痰平喘；神曲辛温，归脾胃经，具有消食和胃的功效。本方配伍用药具有清热化湿，芳香避秽，燥湿止泻等功效；对于治疗COVID-19感染轻中症、疑似患者及时疫感冒症见发热身痛，咽痛咳嗽，腹胀痞满，大便黏腻臭秽或便溏腹泻，纳差乏力等具有显著疗效。在我国新冠肺炎疫情暴发时，清瘟解热合剂用于云南省定点医院及湖北省咸宁市部分受援单位，临床疗效显著。清瘟解热合剂用于老挝、缅甸等我国周边国家及地区，同样取得了良好的临床疗效。

网络药理学是一种常见的研究中药复方作用机制的方法，从中医的整体观念出发，结合辨证论治的方法，多种学科交叉运用，构建成分-靶点-通路网络，探求疾病和药物的联系[4]，为解释中药复杂作用机制提供了方法。本文通过网络药理学检索清瘟解热合剂的活性成分和靶点，进一步推测其治疗COVID-19的作用机制，为清瘟解热合剂临床用于新型冠状病毒肺炎治疗，提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 清瘟解热合剂成分筛选 检索中药系统药理学数据库和分析平台 TCMSP（http：//ibts.hkbu.edu.hk/lsp/tcmsp.php）[5]以“藿香，柴胡，黄芩，连翘，法半夏，草果，茵陈，马蹄香，甘草，滑石，厚朴，白薇，神曲”作为关键词进行查询。中药复方通常以口服为主，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）是药物吸收、分布、代谢、排泄（ADME）中重要的药动学参数之一，表示口服药物的有效成分或活性基被吸收到达体循环并吸收的速度与程度，OB值越高通常表示药物的生物活性越好[6]。类药性（drug-like，DL）是指化合物与已知药物的相似性，是化合物能够成为药物的评价指标[7]，通常以OB≥30%，DL≥0.18作为标准进行筛选得到清瘟解热合剂的活性成分。

1.2 有效成分靶点的预测和基因名的确定 采用TCMSP数据库对清瘟解热合剂的作用靶点进行预测，再利用 UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）[8]规范与活性成分相关的靶点蛋白，获得靶点对应的基因名。

1.3 疾病靶点的筛选 以“corona virus disease 2019”和“novel coronavirus pneumonia”作为关键词，在 OMIM 数据库[9]（http：//omim.org/）和 Genecards数据库[10（]https：//www.genecards.org）中搜索疾病相关靶点。运用Venny平台（版本2.1，http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将清瘟解热合剂作用靶点与COVID-19靶点取交集，得到清瘟解热合剂治疗COVID-19的相关靶点。

1.4 蛋白相互作用网络建立 将1.3得到的交集靶点导入 String 数据库（https：//string-db.org）[11]，得到蛋白相互作用关系的网络图。蛋白间的连线越多，关联度越大，成为核心靶点的概率越高。

1.5 GO分析和KEGG分析 将筛选出来的交集靶点导入 DAVID 数据库[12]（http：//www.david.niaid.nih.gov）中进行基因功能（gene oncology，GO）富集分析，运用 KOBAS3.0 数据库（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn）对核心靶点进行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）基因通路富集分析，以 p≤0.05、q≤0.05作为筛选指标，并对结果进行可视化处理。

1.6 药物成分-靶点-通路网络的建立 在Cytoscape3.7.2[13]中导入预测药物的活性成分、核心靶点以及相关联的通路，构建药物成分-靶点-通路相互作用网络，通过网络对其相互作用机制进行阐述。

1.7 清瘟解热合剂药材-归经网络的建立 方中饮片的归经信息从2015年版《中国药典》中获取，通过查取归经信息构建清瘟解热合剂的药材-归经网络。

2 结果

2.1 清瘟解热合剂成分筛选结果 清瘟解热合剂活性成分筛选共得到1 357种，其中甘草280种、法半夏116种、藿香94种、茵陈53种、草果59种、连翘150种、黄芩58种、柴胡288种、马蹄香3种、滑石1种、白薇81种、炒厚朴139种、炒神曲35种。以OB≥30%，DL≥0.18，筛选后共有264种成分符合条件，见图 1、表 1。

表1 清瘟解热合剂包含化学成分的对应靶标数

图1 清瘟解热合剂各味药物主要有效成分数量

2.2 有效成分靶点收集结果 在TCMSP中查询到510个有效成分靶点，将有效成分靶点名称导入UniProt数据库，得到靶点对应的基因名。

2.3 疾病靶点筛选结果 在OMIM数据库和Genecards数据库中共收集到752个COVID-19相关靶点，其中OMIM数据库中有493个靶点，Genecards数据库中有259个靶点。将疾病靶点和药物成分靶点，取交集最终得到32个清瘟解热合剂治疗COVID-19的潜在靶点，见图2。

图2 药物靶点-疾病靶点韦恩图

2.4 PPI网络构建 构建的PPI网络中有30个作用节点，共231条相互作用连线。其中白细胞介素6（interleukin 6，IL6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、趋化因子（C-C motif ligand 2，CCL2）和丝裂原活化蛋白激酶 1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）的连通度较高，是核心靶点，见图3、表2。

表2 靶点连通度

2.5 靶点通路分析 GO功能富集分析得到GO条目共283条，其中生物过程（BP）条目226个，细胞组成（CC）条目 26个，分子功能（MF）条目 31个，分别占80%、9%、11%。我们根据P值将生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）中的各前 15名列出，见表3。

图3 靶点相互作用网络

表3 清瘟解热合剂GO生物功能富集分析

KEGG通路富集分析共得到232条通路，根据p值筛选出与COVID-19有关的前10条通路，包括IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、Th17细胞分化（Th17 cell differentiation）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等通路，见表4。

2.6 成分-靶点-通路网络构建 将筛选出来靠前的30条通路和药物预测有效成分和疾病潜在靶点导入Cytoscape3.7.2，通过构建成分-靶点-通路网络来阐释其复杂的作用机制，不同节点分别代表、成分、靶点、通路。红色三角代表-靶点，蓝色四边代表-信号通路，绿色四边代表-活性成分，连线代表-各点之间的相互关系，见图4。

2.7 清瘟解热合剂药材-归经网络 根据清瘟解热合剂的归经信息，构建药材-归经网络，图中黄色方块表示药材，绿色圆表示归经。途中连接最密切的三个节点是肺 lung）、脾（spleen）和胃（stomach），连接度分别是8，8，8，说明大多数药材的归经是肺经、脾经和胃经。清瘟解热合剂中13味中药大部分中药归肺、脾、胃三经，说明可能对由“湿热”导致的新型冠状病毒肺炎具有很好的治疗作用，见图5。

表4 KEGG富集通路分析结果

图4 清瘟解热合剂治疗新型冠状病毒肺炎“成分-靶点-通路”网络图

图5 清瘟解热合剂药材-归经网络图

3 讨论

自新型冠状病毒肺炎爆发以来，全国疫情防控阻击战取得重大战略成果，然而世界范围内，情况依然不容乐观。针对新型冠状病毒肺炎，目前临床还没有特效药。虽然有报道称已经筛选了部分药物用于临床，但其是否有确切的治疗作用尚不明确，部分药物还处于试验阶段，不能广泛运用于治疗中。中医药作为我国的传统医药，在疫病的防治上具有独特的见解。2003年，中医药用于重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）治疗的有效性和安全性得到了广泛的认可[14]。吴鞠通的《温病条辨》云：“温疫者，厉气流行，多兼秽浊，家家如是，若役使然也。”[4]新型冠状病毒肺炎中医范畴属于“疫病”，致病原因多为外感疫毒邪气，入里化热，在临床上以“急则治标，缓则治本，标本兼治”作为治疗原则，祛邪外出的同时兼顾扶助正气。最新发布的《新型冠状病毒肺炎诊治方案（试行第七版）》[15]指出，患者以发热、干咳、乏力为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。从中医的角度分析，其病位在肺，兼在脾胃，病因为“湿毒疫”，因邪气侵肺，耗伤卫气而出现发热、咽痛咳嗽；湿邪困脾而导致大便黏腻臭秽或便溏腹泻。根据中医理论分析，清瘟解热合剂中的药物多归肺脾胃经，主要治疗邪犯肺卫、湿邪困脾。半夏、藿香辛温归脾胃肺经，能化湿止呕；茵陈清利湿热；草果燥湿温中，截疟祛痰；连翘、黄芩苦寒，清热解毒、疏散风热、燥湿；柴胡疏散退热，升举阳气；甘草补脾益气，抵抗病邪；马蹄香、滑石、白薇能利尿通淋；厚朴燥湿行气、消痰平喘；神曲能消食和胃。使用此方能清热化湿，芳香避秽，燥湿止泻，在临床治疗患者具有良好的疗效。

基于临床治疗结果，部分SARS-CoV-2感染者后期病症加重，甚至出现死亡的情况，可能与“炎症风暴”有关，而“炎症风暴”的本质是细胞因子风暴（cytokine storm）。细胞因子在人体中有着重要的作用，调控细胞增殖和分化、血管发生、免疫和炎症反应等。当患者感染病毒后，血清中的促炎因子会增加，从而导致肺部炎症和相应的肺组织损伤。过度的免疫反应激活大量的免疫细胞，对肺泡上皮细胞和毛细血管造成弥漫性损伤，大量液体渗出到气管中阻塞气道，从而造成呼吸窘迫[16]。蛋白互作分析结果表明，IL6、TNF、CCL2、MAPK1等可能为清瘟解热合剂治疗COVID-19的核心靶点。此外，通过比较KEGG通路富集分析的结果，发现这些核心靶点显著富集在IL-17信号通路、Th17细胞分化、肿瘤坏死因子信号通路等通路上。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）是一种细胞中的重要信号传导分子[17]，在炎症反应中发挥着重要的作用，MAPK激活后可促进细胞症因子表达[18-19]。与此同时，一些促炎性因子如TNF-α、IL6等，都可以激活MAPK通路从而加剧炎症反应[17]。在炎症反应中，TNF-α是一种出现最早、最重要的炎性因子，主要由单核巨噬细胞以及其它免疫细胞产生。在机体感染病毒时，TNF-α可通过激活 T细胞促进 IL-1、IL-6、IL-8和IL-12等细胞因子的产生及分泌，从而介导一系列炎性反应[20]。CC趋化因子配体2（CCL2）是CC类趋化因子家族的成员，是人类发现最早的、有活性的趋化因子。当CCL2与其相应受体结合后可活化单核/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和Th2细胞，并向炎症部位聚集。有研究表明由支气管上皮细胞和巨噬细胞产生的CCL2可能会加重气道炎症和气道高反应性[21]。对肺炎患者血清中的细胞因子进行分析，发现重症患者血清中的IL-6、TNF-α等明显高于非重症患者，这说明这些患者症状的加重与这些细胞因子的升高有关。Th17细胞是新型CD4+T细胞亚群，在免疫调节方面具有至关重要的作用，Th17细胞可以分泌IL-6、TNF-α和IL-17等多种效应因子，并通过其来介导炎症反应。IL-6可以调节Th17细胞的数目并诱导其发育[22]。因此，清瘟解热合剂可能通过调控这些通路改善COVID-19患者的炎症反应。

综上所述，本研究通过网络药理学方法对清瘟解热合剂中有效成分治疗新型冠状病毒肺炎的作用进行了研究。结果显示，清瘟解热合剂可能是通过多成分、多靶点、多通路来协同作用的。网络药理学是大数据时代下的新兴的学科，通过虚拟筛选技术初探了清瘟解热合剂对COVID-19的治疗作用机制，为临床应用提供了理论依据，但由于研究方法本身具有局限性，需要在临床中进一步试验验证。