布鲁氏菌鞭毛钩蛋白FlgE和融合蛋白BLS-FlgE的克隆、表达及免疫诊断研究

路殿英，姜 海, 田国忠，杨晓雯，赵鸿雁，朴东日，魏俊妮

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属的细菌侵入机体后引起的传染-变态反应性人兽共患病[1-2]。由于布鲁氏菌胞内寄生的特点，天然的具有逃避宿主机体的固有免疫和适应性免疫的能力，想要完全的消灭它尚有很长的一段路要走[3]。经查阅文献了解到布鲁氏菌具有除趋化基因外几乎全部的鞭毛基因，并且有研究表明布鲁氏菌在侵入机体后会有短暂的鞭毛表达情况[4]。鞭毛蛋白作为革兰氏阴性菌的主要结构蛋白，当其与其它抗原结合时表现出强大的免疫原性，而布鲁氏菌LS蛋白(BLS)是布鲁氏菌的一种优势抗原，是由2个五聚体组成的结构稳定的十聚体，为光滑型和粗糙型布鲁氏菌所共有，用于布鲁氏菌的诊断可提高其敏感性；另外BLS可以激发抗原特异性细胞应答产生IFN-γ，从而对宿主产生保护力，是一种理想的布鲁氏菌病亚单位疫苗的候选蛋白。故本研究尝试表达布鲁氏菌鞭毛钩蛋白F1gE和融合蛋白BLS-F1gE以期找到布鲁氏菌病更合适的诊断抗原。

1 材料与方法

1.1菌株、质粒和血清样品 羊种布鲁氏菌16M核酸由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所布鲁氏菌病室保存，pET-30a质粒由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室提供。布病阳性病人血清收集自新疆乌兰察布旗疾控中心，健康人血清收集自北京市昌平区疾控中心。

1.2主要试剂 HRP标记的山羊抗人IgG抗体，TMB显色液购自康为世纪公司，LB培养基组分(酵母提取物和胰蛋白胨)购自Oxoid公司，BL21感受态细胞购自全式金生物公司，DH5α感受态细胞购自擎科生物公司，IPTG购自AMRESCO公司，His标签纯化试剂盒(可溶性)购自康为世纪生物公司。

1.3 引物设计与PCR扩增

1.3.1表达鞭毛钩蛋白FlgE 从NCBI网站下载布鲁氏菌鞭毛钩蛋白基因flgE的基因序列，利用clone manager软件设计其两侧引物以表达鞭毛钩蛋白FlgE。引物信息如下：上游引物：5′- GGAATTCATGAGCCTCTACGGTATGATG -3′，下游引物：5′- CCCTCGAGTCTCTTCAGATTAACCAGCACGTC -3′，酶切位点：EcoRⅠ和XhoⅠ。

1.3.2获得融合基因 从NCBI网站下载布鲁氏菌bls的基因序列, 利用clone manager软件将去除终止子的BLS基因序列与鞭毛基因序列连接，并在此基础上设计两侧的酶切引物和中间的融合引物,融合引物a与b之间碱基互补且各自含有bls和flgE基因序列的一部分。利用PCR常规技术多次扩增得到该融合基因序列。引物信息如下：上游引物：5′-CGGGATCCATGAACCAAAGCTGTCCGAAC-3′，下游引物：5′- CCCTCGAGTCTCTTCAGATTAACCAGCACGTC -3′，融合引物a: 5′- CTTGTCATGAGCCTCTACGGTATGATGC-3′，融合引物b: 5′- GCTCATGACAAGCGCGGCGATGCGGCTGC-3′。

1.4双酶切鉴定、蛋白表达与纯化 将得到的目的基因与质粒同时进行双酶切反应(37 ℃,2 h),酶切产物使用DNA连接酶连接(16 ℃，过夜)，酶连产物转化至DH5α感受态细胞，按一定比例涂布于具有卡纳抗性的培养基上，挑选阳性克隆子，进行质粒双酶切鉴定及测序鉴定，构建成功的重组质粒转化入BL21感受态细胞以供表达。构建成功的重组质粒pET30a-flgE和pET30a-bls-flgE分别调整蛋白表达条件予以表达，对表达前OD值、温度、转速、时间等条件进行摸索，以最优表达条件大量表达目的蛋白后使用蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白。

1.5Western Blot验证 选取1 mL诱导表达后的目的蛋白菌液，以同样条件诱导的空载体菌液，超声破碎后进行SDS-PAGE电泳，应用广谱彩虹预染蛋白marker,跑胶结束后进行常规Western Blot实验，TBST作为常规洗液，5%马血清作为封闭液，以阳性病人血清作为一抗，HRP标记的羊抗人(IgG)作为二抗，DAB显色液(HRP)最终显色。

1.6 重组抗原的ELISA检测

1.6.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 将纯化后的重组蛋白用包被液梯度稀释为2 g/mL、4 g/mL、6 g/mL、8 g/mL、10 g/mL和12 g/mL；已知阳性布病血清和健康人血清分4个稀释度1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。计算阳性血清孔与阴性血清孔的平均OD450值之比(P/N),P/N值最大且阳性血清孔OD450值接近1时所对应的抗原包被浓度和阴阳性血清对照的稀释度为最佳条件，确定最终蛋白质包被浓度和血清稀释度。检测的其他条件为：封闭液选取5%脱脂奶粉，酶标二抗稀释倍数为5 000倍，TMB底物作用时间为15 min。

1.6.2封闭液的选取 分别用5%马血清、5%马血清+2% Tween-20、5%脱脂奶粉和5%脱脂奶粉+2% Tween-20共4 种封闭液，4 ℃封闭过夜，分别检测其OD450值， P/N值最大且阳性血清孔OD450值接近1时即为最佳封闭液。

1.6.3酶标二抗稀释倍数与TMB底物显色时间的确定 酶标二抗的稀释度分别为1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000，确定P/N值最大时且阳性血清孔OD450值接近1 时为酶标二抗最佳稀释度；按已确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度进行ELISA，底物的显色时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min、确定P/N值最大且阳性血清孔OD450值接近1 时为底物最佳显色时间。

1.6.4阴阳性临界值的确定 选取临床采集的病原学分离培养判定为阴性的42 份血清作为ELISA方法判定阴阳性临界值的阴性血清。根据公式：阴阳性临界值=阴性样品OD450值平均值+2.58×标准差，计算阴阳性临界值。

1.6.5临床样品血清检测 对46 份布病阳性血清和46 份健康人血清分别进行常规检测(试管凝集实验)和ELISA检测，比较结果，确定此次建立的iELISA方法的灵敏度、特异度和符合率。

2 结 果

2.1目的基因PCR结果 应用设计好的PCR反应体系和程序，添加对应引物，目的基因扩增结果见图1。其片段大小与预计长度相符。flgE片段长度为1 191 bp；bls-flgE片段长度为1 668 bp，条带较为明显。

M为DNA marker；a为flgE；b为bls-flgE图1 重组蛋白基因片段扩增Fig.1 Amplification of recombinant proteins gene fragment

2.2重组质粒酶切结果 对菌落PCR鉴定阳性的克隆子进行质粒双酶切鉴定。酶切结果见图2，载体和目的基因处在预期的位置，载体构建成功。

M为DNA marker；a和b分别为flgE、bls-flgE双酶切鉴定结果图2 蛋白重组质粒双酶切鉴定Fig.2 Identification of protein recombitant plasmid

2.3蛋白表达结果 将插入质粒的BL21重组大肠杆菌在160 r/min，27 ℃、30 ℃、32 ℃及0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L IPTG浓度条件下进行诱导，表达的重组蛋白经过SDS-PAGE电泳分析，鞭毛钩蛋白FlgE的最佳诱导条件为27 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导浓度，此条件下表达蛋白主要以可溶性状态存在，而融合蛋白BLS-FlgE的最佳诱导条件为32 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导浓度，此条件下表达蛋白主要以可溶性状态存在。经过镍柱纯化后大部分杂蛋白被去除，最后得到的蛋白纯度较高。见图3。

A(插入pET30a-flgE质粒)：M为Marker；a1为27 ℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导18 h的全菌蛋白；a2为30 ℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导18 h的全菌蛋白；a3为32 ℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导18 h的全菌蛋白；a0为纯化后的FlgE蛋白。B(插入pET30a-bls-flgE质粒)：M为Marker；b1为27 ℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导18 h的全菌蛋白；b2为30 ℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导18 h的全菌蛋白；b3为32 ℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导18 h的全菌蛋白；b0为纯化后的BLS-FlgE蛋白。图3 SDS-PAGE分析蛋白表达与纯化情况Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression and purification of flagellar protein

2.4重组蛋白鉴定结果 以布鲁氏菌病阳性病人血清为一抗，HRP标记山羊抗人IgG作为二抗进行检测，结果显示FlgE蛋白和BLS-FlgE蛋白均能与阳性病人血清反应，具有抗原性，分别在41 kDa和58 kDa处出现特异性条带，见图4。

M为maker；a和b分别为FlgE和BLS-FlgE WB鉴定结果图4 重组蛋白与病人阳性血清Western blot检测结果Fig.4 Western blot of recombinant proteins against human positive serum samples

2.5以重组蛋白为包被抗原的检测方法的建立 确定重组鞭毛钩蛋白FlgE最佳包被浓度为12 g/mL，血清最佳稀释度为1∶50，5%脱脂奶+0.1%Tween-20为最佳封闭液，酶标二抗的最佳工作稀释度为4 000倍，底物最佳显色时间为10 min，结果见表1—4。检测42份阴性血清，计算得出，平均OD450的值为0.380，标准差(s)为0.063，阴阳性临界值为0.543。因此，确定被检血清样品的OD450≥0.543即判定为阳性，OD450<0.543即可被判定为阴性。

表1 采用不同抗原包被浓度和血清稀释度进行ELISA得到的P/N值Tab.1 P/N values obtained by ELISA using different antigen coating concentrations and serum dilutions

表2 采用不同封闭液进行的ELISA得到的P/N值Tab.2 P/N values obtained by ELISA using different blocking solutions

表3 采用不同底物显色时间进行的ELISA得到的P/N值Tab.3 P/N values obtained by ELISA using different substrate coloring time

表4 采用不同二抗稀释度进行的ELISA得到的P/N值Tab.4 P/N values obtained by ELISA with different dilutions of secondary antibodies

同样的流程下确定重组融合蛋白BLS-FlgE最佳包被浓度为10 g/mL，血清最佳稀释度为1∶100，5%脱脂奶+0.1%Tween-20为最佳封闭液，酶标二抗的最佳工作稀释度为2 000倍，底物最佳显色时间为15 min。检测42 份阴性血清，计算得出，平均OD450的值为0.356，标准差(s)为0.058，阴阳性临界值为0.506。因此，确定被检血清样品的OD450≥0.506即可被判定为阳性，OD450<0.506即可被判定为阴性。

2.6临床血清样品的检测 如表5所示，以试管凝集法作为参照标准，FlgE蛋白和BLS-FlgE蛋白单独作为布病诊断抗原表现出灵敏度和特异度均低的特点。

表5 两重组蛋白ELISA法评价指标结果Tab.5 Evaluation results of two recombinant proteins by ELISA

3 讨 论

病原分离和鉴定是布鲁氏菌病诊断的金标准，但因其要求条件高，各项操作均须在P3实验室进行，费时费力，过程繁琐，所以一般不用此方法检测诊断。如今已经出现许多布鲁氏菌血清学检测方法，有20 种以上，其中大多数原理是检测布鲁氏菌表面的脂多糖抗原，如试管凝集试验、虎红平板凝集试验、缓冲平板凝集试验、间接ELISA和荧光偏振试验等[5-8]。

经基因组测序发现，布鲁氏菌具有除趋化基因外所有鞭毛结构基因，并被认为属于隐性遗传物[9-11]。通过构建鞭毛蛋白和保护性抗原结合后的融合蛋白，由此方法已经产生许多证明有效的诊断试剂。本研究构建了flgE、bls-flgE基因的原核表达质粒，经IPTG诱导，均能以可溶性蛋白的形式表达。优化FlgE蛋白诱导条件时发现，不同的诱导时间、诱导前OD600值等条件下表达量未出现明显变化。低温诱导(27 ℃)表达量要显著高于高温诱导(32 ℃)，这可能是因为温度高会使表达物大量降解的关系。对于BLS-FlgE蛋白，不同诱导条件的摸索蛋白表达产量未有明显变化。经过Western Blot的鉴定，FlgE蛋白与BLS-FlgE蛋白均能被布病阳性病人血清识别，说明其具有良好的免疫原性，为之后建立布病新的诊断方法奠定了基础。然而通过ELISA检测法与常规检测法对比，该诊断方法灵敏度和特异度均较低，整体符合率低，免疫诊断价值较低，均不适合单独作为诊断抗原。但以BLS-FlgE融合蛋白作为包被抗原建立的ELISA法特异度要高于以FlgE蛋白作为包被抗原建立的ELISA法，推测BLS蛋白在一定程度上可增加融合蛋白的免疫原性。

根据本研究建立的重组抗原的iELISA方法检测样品，与常规布鲁氏菌病血清学方法相比检测结果差异较大，灵敏度和特异度均较低，分析其原因可能有以下几点：①人群中存在潜伏感染者影响结果；②蛋白抗原纯度不够、等电点不合适等因素；③优化条件不完善。下一步应提高抗原纯度，进一步优化条件，并根据金标准来评价本检测方法，与常规血清学方法等结果比较做出系统的评价。

利益冲突：无