神经肌肉电刺激预防废用性肌萎缩作用机制及研究进展

杨佳佳，徐义明，白跃宏

骨骼肌的生长和维持依赖于对肌肉活动与机械负荷的刺激反应，肌肉活动减少或机械负荷减少都会导致废用性肌萎缩，如因疾病长期卧床、骨折外伤石膏固定及其他原因需肢体制动等均会造成废用性肌萎缩，其主要特征是肌肉蛋白合成代谢下降，分解代谢增强，主要表现有肌肉湿重减少、肌纤维横截面积减少、慢肌纤维向快肌纤维转换、肌肉力量下降等［1-3］。

神经肌肉电刺激作为肌萎缩的一种常用物理治疗手段，可诱导骨骼肌非自主收缩，替代废用状态下肌肉活动，限制或逆转废用状态下肌萎缩进程的发生［4］。神经肌肉电刺激诱导的收缩使肌肉容积、横截面积增加、蛋白质合成增加等［5-6］。但利用神经肌肉电刺激预防废用性肌萎缩的机制尚不明确，故对于最佳刺激方案，如刺激频率、作用时间及周期的选择，目前亦无统一的说法，了解神经肌肉电刺激在预防肌萎缩中的作用机制可为临床诊疗策略制定提供实验依据，本文拟从废用性肌萎缩发生机制以及神经肌肉电刺激作用机制展开论述。

1 促进肌肉蛋白合成

1.1 Akt 相关信号通路 激酶Akt(又称蛋白激酶B)是骨骼肌生长相关级联反应中的重要成分，Akt 可活化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）调控肌蛋白质合成，Akt 信号传导能够使葡萄糖转运蛋白4（Glucose Transporter 4，GLUT4）易位到细胞膜，增加骨骼肌对葡萄糖的摄取，从而对抗肌萎缩[7]。在后肢悬吊的废用性肌萎缩试验模型中，Akt/mTOR 信号通路是被抑制的[8]。研究发现电刺激可使肌微管细胞的Akt，GLUT4 激活和表达上调[9]。另一方面，Akt 通过调控叉头盒O（Forkhead box O，FOXO）的磷酸化水平调节肌蛋白降解过程。动物实验中，通过给予后肢悬吊14d 的大鼠100Hz 的神经肌肉电刺激，观察到Akt 活化、FoxO3a磷酸化水平上升，比目鱼肌萎缩情况得到缓解[10]。Dirks 等[11]对重症卧床肌萎缩病人神经肌肉电刺激的研究中，通过对6 名患者采取自身双侧股四头肌刺激对照的方式，予以侧股四头肌频率为100Hz 的神经肌肉电刺激，每天2 次，每次30min，持续7±1d，对照组不予神经肌肉电刺激，但仍安放电极，结果表明：对照组肌肉横截面积减少了20%，电刺激组未检测到明显肌萎缩，电刺激组FOXO1 的信使RNA（Messager RNA，mRNA）水平下降，mTOR 磷酸化水平增高。上述研究表明Akt 相关信号通路在废用性肌萎缩中扮演着重要角色，神经肌肉电刺激能通过激活蛋白合成相关的Akt/mTOR 途径同时抑制Akt/FOXO 蛋白降解途径来缓解废用性肌萎缩。

1.2 MAPK 信号通路 哺乳动物丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）家族由几种信号分子包括细胞外调节激酶（Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（CJun Amino-terminal Kinase，JNK）及p38 组成，他们通过调控基因表达来调节肌细胞的增殖、分化及凋亡，ERK 和p38 也通过丝裂原和应激激活激酶的磷酸化来增加帽状mRNA 的翻译，进而增加肌纤维蛋白的合成[12]。在各种诱导因素（包括神经肌肉电刺激，负重，阻抗运动和耐力性活动）作用下，均可检测到激酶（JNK、ERK、P38）的激活[13]。在大鼠的废用性肌萎缩模型中，JNK，P38 和ERK 的表达降低，而通过频率为30Hz，每天30min，持续30d 的神经肌肉电刺激后，肌纤维中JNK，ERK，P38 的表达上调，肌萎缩得到缓解，说明神经肌肉电刺激可通过激活MAPK 信号通路，延缓废用性肌萎缩的发生[14]。

2 抑制肌肉蛋白水解

2.1 抑制泛素蛋白水解相关途径 骨骼肌萎缩发生时，泛素-蛋白酶体系统协调蛋白水解分子程序，对靶蛋白进行泛素化，完成蛋白质的降解过程。其中，泛素连接酶E3 对靶蛋白的特异识别是蛋白降解的关键。肌肉萎缩盒F 蛋白（Muscle Atrophy F-boX，MAFbx）和肌环状指蛋白1（Muscle RING Finger1，MuRF1）是两种肌肉特异性表达的泛素连接酶E3，MAFbx 与MuRF1 的mRNA 水平在肌萎缩早期都明显上升，可能与肌萎缩的启动有关[15]。上述Dirks M L等在健康志愿者的肌萎缩模型的研究中，通过5d 的单侧下肢制动建立短期肌萎缩模型，实验组（n=12）予100Hz，每天2 次，每次40min 的神经肌肉电刺激治疗，对照组（n=12）不予电刺激，与对照组MAFbx 和MuRF1 升高相比，实验组MAFbx 和MuRF1 无明显变化，表明电刺激可阻止肌萎缩连接酶的表达而缓解肌肉废用性肌萎缩［16］。但Dirks 等［11］随后在重症患者肌萎缩的研究中，肌萎缩患者对照组与电刺激组MAFbx 和MuRF1 表达均增高，统计学无明显差异。两次试验的结果的差异可能与废用性肌萎缩的模型不同有关，故尽管泛素蛋白水解系统在废用性肌萎缩中有重要作用，但电刺激在泛素蛋白水解系统中的作用尚需更进一步的研究。

2.2 阻断钙蛋白酶活性 泛素蛋白酶体系统不能直接降解完整的肌原纤维内蛋白质，需要钙蛋白酶切割肌巨蛋白、伴肌动蛋白等使肌原纤维解分解[17]。研究表明，阻断钙蛋白酶活性可抑制泛素蛋白酶体途径活化，保留肌肉蛋白合成代谢信号，减少废用性骨骼肌萎缩[18]。研究中，将大鼠后肢悬吊14d 建立肌萎缩模型，实验组予以胫骨前肌100Hz 神经肌肉电刺激。结果发现，相比空白对照组，后肢悬吊后的钙蛋白酶2 的表达仅轻度升高，且电刺激未使钙蛋白酶的表达发生明显变化，表明后肢悬吊的废用性肌萎缩模型中，神经肌肉电刺激胫骨前肌时可能并非通过调节钙蛋白酶的表达缓解废用性肌萎缩[19]。

3 阻止肌生成抑制蛋白表达

肌生成抑制蛋白是一种肌生成负向调节因子，其通过阻滞成肌调节因子使肌生成基因表达受阻［20］，研究表明肌生成抑制蛋白明显促进废用性骨骼肌萎缩［21］。在Dirks 等［16］的试验中检测到实验组肌生成抑制蛋白mRNA 未发生改变，肌肉横截面积及肌肉湿重均未明显下降，而对照组肌生成抑制蛋白mRNA 表达上升。故阻止肌生成抑制蛋白的表达是神经肌肉电刺激缓解肌萎缩的可能机制之一。

4 减少卫星细胞凋亡

卫星细胞作为一种替补细胞，在骨骼肌损伤后活化募集，分化为成肌细胞，对肌纤维的修复，维持和生长有重要作用［22］。在废用性肌萎缩发生时，卫星细胞数量下降，再生能力不足［23］，神经肌肉电刺激通过增强卫星细胞的活化和增生，保持足够的卫星细胞池，促进肌纤维再生从而缓解肌肉萎缩进程［24］。试验证明，后肢悬吊28d 大鼠模型中，予比目鱼肌20Hz，每天2 次，每次1h 的神经肌肉电刺激可减少卫星细胞的丢失，增加肌纤维的横截面积［25］。另一项动物实验室中，对新西兰兔后肢固定建立腓肠肌废用性肌萎缩模型，给予腓肠肌8Hz，每天1 次，每次1h，持续2 周的微电流电刺激，检测到卫星细胞有丝分裂活性增加，卫星细胞数量增加，肌萎缩得到明显缓解，表明电刺激可通过刺激肌卫星细胞增值分化来促进萎缩肌肉再生［26］。

萎缩肌中的卫星细胞需要不同的刺激方案，用于不同的细胞活动，如激活，增殖和肌原性分化，刺激参数的优化可能会强化干预的结果。后肢悬吊14d 大鼠试验模型中，予以2 Hz，每天2 次，每次1h 的神经肌肉电刺激参数使卫星细胞增殖增加2 倍，在阻止肌纤维横截面积减少方面达到最佳效果［27］。

5 线粒体及氧自由基的变化

线粒体是参与细胞能量代谢、细胞分化与凋亡及信号传递的重要细胞器。废用状态下肌纤维内线粒体体积及位置发生改变，使线粒体功能受损，产生大量活性氧造成细胞氧化性损伤，破坏正常的膜系统功能，进一步使线粒体肿胀，同时溶酶体膜破坏［28］。损伤的线粒体氧化磷酸化水平出现障碍，能量产生不足，蛋白合成下降；膜破坏后的溶酶体释放蛋白水解酶，使蛋白质分解增加［29-30］。电刺激可能通过影响线粒体分裂和融合相关蛋白（Fis1、Drp1、Mfn1、Mfn2 、Opa1）的表达从而达到线粒体质量控制和线粒体功能改善，进而缓解肌肉蛋白的丢失［31］，但目前尚缺乏在废用性肌萎缩中，电刺激对线粒体相关蛋白表达的影响。

除了上述机制外，也有学者从神经肌肉电刺激通过调节微小RNA（microRNA）表达从而促进肌肉蛋白表达展开研究。肌肉特异性microRNA（myomiRs）是一种含有22 个核酸的保守微小RNA，其中miR-1和miR-206 通过靶向胰岛素样生长因子1（Insulin-like Growth Factor 1，IGF1）的3'非编码区从而阻止其翻译，与肌肉蛋白的减少相关［32］。myomiRs 在肌生成中扮演的角色是多重的，其也直接靶向Pax3 和Pax7 启动肌生成程序［33］。目前已对几种肌萎缩模型包括去神经、禁食、糖尿病、癌症恶病质状态下的小鼠肌肉的miR 进行了分析，明确了在不同代谢情景下的miR 独特表达模式［34］。如研究者给予慢性肾衰竭相关性肌萎缩患者20Hz 神经肌肉电刺激，发现miR-1 和miR-206表达增加，肌细胞生成增多，表明慢性肾衰竭相关性肌萎缩中，神经肌肉电刺激可以通过增加miR-1 和miR-206 促进肌细胞蛋白生成［35］。在慢阻肺相关性低氧高二氧化碳导致的肌萎缩大鼠模型中，检测到肌萎缩发生时，MiR486 明显减少，但经过神经肌肉电刺激后，MiR486 表达增高［36］。但在废用性肌萎缩模型中，对神经肌肉电刺激后microRNA 表达情况尚未有相关研究，也是目前的研究方向之一。

6 小结

上述研究表明，神经肌肉电刺激预防废用性肌萎缩的疗效是肯定的，在预防机制的研究中，肌肉蛋白合成相关通路Akt 途径及MAPK 途径的活化有重要作用；同时，神经肌肉电刺激也可通过促进卫星细胞增值，抑制肌生成抑制蛋白的合成来缓解废用性肌萎缩；线粒体质量控制及功能改善、microRNA 相关通路改变也是可能机制之一，进一步明确需要更深入研究；尽管泛素蛋白酶体及钙蛋白酶是肌萎缩中肌肉蛋白降解的主要途径，但神经肌肉电刺激对泛素蛋白酶及钙蛋白酶的作用情况尚有争议。综上可知，神经肌肉电刺激预防废用性肌萎缩的机制中，促进肌蛋白合成的作用比抑制肌蛋白降解的作用更明显，同时通过促进卫星细胞再生分化也是电刺激预防废用性肌萎缩的主要机制之一。