114例疑似COVID-19患者呼吸道病毒感染分析

李宝林，袁 兰，叶 婷，田 刚，曾章锐，蔡宛玲，罗思剑，刘靳波

2019 年12月在中国湖北省武汉市首次报道有新型冠状病毒感染的肺炎病例，此后在其他省份相继有报告类似病例[1-2]。2020年2月11日国际病毒分类委员会将新型冠状病毒正式命名为SARS-CoV-2，2020年2月22日，国家卫健委正式将新型冠状病毒肺炎英文名称修订为COVID-19[3]。在最新的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》[4]中阐述病例诊断需具备病原学特征之一：1)实时荧光RT-PCR检测SARS-CoV-2 核酸阳性；2)病毒基因测序，与已知的 SARS-CoV-2 高度同源。因此准确、及时的病原学核酸检测已成为诊断 SARS-CoV-2感染的重要环节。同时在第六版方案鉴别诊断中指出：新型冠状病毒感染轻型表现需与其它病毒引起的上呼吸道感染相鉴别；新型冠状病毒肺炎主要与流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原体感染鉴别。强调“对疑似病例要尽可能采取包括快速抗原检测和多重PCR核酸检测等方法，对常见呼吸道病原体进行检测”。

引起发热、咳嗽等上呼吸道症状，又能感染下呼吸道引起肺炎，类似SARS-CoV-2感染的病原体有多种，如SARS冠状病毒[1]。SARS-CoV-2病毒更容易传播，潜伏期更长[5]，这给临床诊断带来很大困难，及时有效的鉴别出患者病原体感染，在疫情防控中将起到重要作用。本研究对西南医科大学附属医院114例COVID-19疑似患者咽拭子标本进行回顾分析，检测患者是否有其它呼吸道病毒感染。

1 材料与方法

1.1标本来源 2020年2月1日至2020年2月12日，收集西南医科大学附属医院114例新冠疑似患者咽拭子标本，114例门诊患者均有发热、咳嗽等上呼吸道症状，部分患者有下呼吸道症状。男性55例，女性59例，年龄最小出生16 d，最大80岁。

1.2试剂与仪器 半自动核酸提取仪EX3600及配套核酸提取试剂(批号：P20200203)购自上海之江生物科技股份有限公司。SARS-CoV-2核酸扩增试剂由湖南圣湘生物科技股份有限公司(批号：2020004)和上海之江生物科技股份有限公司(批号：P20200203)提供。SARS-CoV-2核酸扩增设备ABI7500荧光定量PCR仪购自美国Thermofisher公司。呼吸道病毒核酸检测试剂盒及配套核酸检测设备加热离心机、RTisochipTM-A微流控芯片核酸分析仪购自成都博奥晶芯生物科技有限公司。

1.3标本的采集与处理 咽拭子标本采集按照国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第四版)》进行采集[6]，将收到的标本置于56 ℃烤箱中30 min进行灭活处理，灭活后标本管在振荡器振荡不低于2 min。核酸的提取：取1 000 μL标本洗脱液13 000 r/min离心10 min，弃部分上清，留取300 μL上清液与沉淀混匀，将混合物吸入EX3600核酸提取仪预装板A孔中，将预装板置于设备固定位置，启动核酸提取程序提取核酸，洗脱体积70 μL。

1.4SARS-CoV-2核酸的扩增 SARS-CoV-2核酸扩增引物及探针均由湖南圣湘提供，有2个靶序列。FAM区域靶标(ORF 1ab)：ROX区域靶标(N基因)：内标通道VIC检测人体细胞核糖核酸酶P(Ribonuclease P，RNase P)，所有检测标本核酸同时再用上海之江SARS-CoV-2扩增试剂扩增验证ORF 1ab和N基因，所有操作均按照试剂说明书操作。核酸确诊阳性根据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第四版)》要求进行判读。

1.5呼吸道病毒核酸扩增 按照博奥呼吸道病毒核酸检测试剂盒说明书操作，呼吸道病毒核酸扩增结果判读：结果由软件自动分析，出现S型曲线且Tp(Time postive)值≤35，则判断为阳性。出现S型曲线且Tp值>35，报告为疑似阳性。当无S型曲线且Tp值显示为“-”，则判断为阴性。Tp值定义：“S”型曲线进入快速扩增期的第1个拐点，拐点对应的时刻与原点时刻的差值定义为Tp值，单位为min。呼吸道病毒核酸检测指标有：甲型流感病毒2009 H1亚型、甲型流感病毒季节性 H1亚型、甲型流感病毒季节性 H3亚型、甲型流感病毒 H7亚型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒/鼻病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒A6型、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、人副流感病毒4型、人偏肺病毒、冠状病毒OC43/HKU1型、冠状病毒NL63/229E型。

2 结 果

2.1COVID-19疑似患者SARS-CoV-2核酸扩扩增曲线 采用2种试剂平行对114例COVID-19疑似患者进行SARS-CoV-2核酸扩增，扩增结果均为阴性。部分患者内标基因扩增曲线见图1，图1A是由湖南圣湘检测试剂进行扩增，内标Ct值集中在20～25之间，图1B是由上海之江检测试剂进行扩增，内标Ct值集中在28～31之间。

图1 SARS-CoV-2核酸扩增内标基因扩增曲线

2.2114例COVID-19疑似患者18种呼吸道病毒核酸检测 114例COVID-19疑似患者中，有21例查出非SARS-CoV-2感染的呼吸道病毒，感染率达18.42%，≤20岁有8例，≤40岁有7例，≤60岁有6例。同时感染两种病毒的有3例：病例15混合感染了呼吸道合胞病毒和柯萨奇病毒A16型，病例45混合感染了冠状病毒NL63/229型和人副流感病毒1型，病例74混合感染了甲型流感病毒和甲型流感病毒季节性H3亚型。21例患者中，感染乙型流感病毒有6例，感染呼吸道合胞病毒有5例，感染冠状病毒NL63/229型和肠道病毒/鼻病毒各有3例，感染人偏肺病毒有2例，详见表1。

表1 21例COVID-19疑似患者呼吸道病毒病毒感染分析

2.310种呼吸道病毒恒温扩增曲线及Tp值 21例呼吸道病毒感染患者中，共有10种病毒感染，病毒恒温曲线见图2，其中A代表的是乙型流感病毒。PC(Positive external control)外对照，芯片中预包埋的阳性对照品，检测整个恒温扩增过程是否存在抑制物。IC(Internal control)内对照，扩增样本中的管家基因GAPDH，检测整个采样和提取过程是否合格。图2中的PC和IC扩增都很明显，说明整个实验是成功的。各病例病毒扩增Tp值见表1。

图2 呼吸道病毒恒温扩增曲线图

3 讨 论

2020年1月7日，研究人员从一名武汉患者体内成功分离出SARS-CoV-2病毒并进行了全基因组测序[7-8]，研究发现SARS-CoV-2是冠状病毒的一种，其中有2种冠状病毒，严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)已经在世界范围内引起了了严重急性呼吸道疾病的暴发[9]。SARS-CoV-2发病时常见临床症状有发热、干咳、肌肉疼痛，这些症状和SARS-CoV、MERS-CoV很像，因此，快速准确的临床诊断成为控制疫情的关键，但是面对未知病毒的感染，快速对其进行鉴别诊断、排除其它病毒感染、进行多种病原体检测同样显得重要，在不同版本的《新型冠状病毒感染的肺炎治疗方案》中也多次提出。Chen等[10]研究了99例COVID-19感染患者，发现1例(1%)合并细菌感染，4例(4%)合并真菌感染，汪明等[11]对武汉地区8 274例新型冠状病毒核酸受检者同时进行13种常见呼吸道病原体多重PCR检测，发现SARS-CoV-2阳性患者会合并感染其他病原体。以上都说明，在防控COVID-19疫情时必须把其它病原体纳入检测计划中。本研究将114例COVID-19疑似患者做为研究对象，采用恒温扩增法对其咽拭子标本进行了18种呼吸道病毒检测的回顾性分析，该技术能够快速精准的检测MERS-CoV的ORF基因和N基因，效果优于实时定量RT-PCR[12-13]。通过筛查发现18.42%的SARS-CoV-2核酸阴性患者有呼吸道病毒感染。包括5例婴幼儿和1例儿童，6例患者均感染了不同的呼吸道病毒，这与李权恒等[14]研究有一定出入，也更加说明了呼吸道感染的复杂性。而在所有感染的患者中，从0岁到60岁均有人群感染不同的呼吸道病毒，没有明显年龄易感趋势，这和SARS-CoV-2感染很相似，因此在整个疫情防控中一定要做好呼吸道病毒感染的鉴别。

利益冲突：无