绵羊肝脏、肺脏细粒棘球蚴原头节差异蛋白质表达分析

彭文军，曹得萍，张耀刚，刘 燕，姜博璠，赵海龙

细粒棘球蚴病(囊型包虫病)是细粒棘球绦虫幼虫(棘球蚴)寄生于人及食草类动物和啮齿类动物组织器官而引起的一种严重的人兽共患寄生虫病[1]。全国每年感染棘球蚴的家畜5 000 万头，造成近30亿元的损失[2]。 细粒棘球蚴包囊可寄生在人体任何部位，以肝脏居多 (约占70%)，其次是肺(约占20%)，大脑、肌肉等其他部位约占10%[3]。细粒棘球绦虫广泛流行于青海省南部藏区，其棘球蚴对广大农牧民的身体健康和南部地区畜牧业的发展带来严重影响[4-5]。前期研究[6-7]结果显示人体棘球蚴原头节、囊壁、囊液蛋白质表达有差异，而且棘球蚴和泡球蚴组织蛋白质表达也有差异。本研究利用iTRAQ和LC-MS/MS技术对绵羊肝脏及肺脏分离细粒棘球蚴原头节(肝脏原头节(hepatic protoscoleces, Hepatic_P)和肺脏原头节(lung protoscoleces，Lung_P))进行蛋白质鉴定分析，寻找宿主不同寄生部位棘球蚴原头节特异表达的蛋白质分子，为研究调控细粒棘球蚴生长发育、侵袭、转移等过程蛋白质提供科学依据。研究同一宿主不同寄生部位棘球蚴原头节蛋白质差异表达谱特征对进一步揭示其在同一宿主不同脏器寄生、增殖、分化、凋亡和转移中的作用及其机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1实验标本 收集西宁市牛羊屠宰场感染棘球蚴的绵羊肝脏和肺脏，在实验室无菌状态下分离棘球蚴囊壁、囊液、原头节。原头节用无菌生理盐水漂洗3遍，-80 ℃保存备用。

1.2原头节总蛋白质制备和SDS电泳 本实验共收集4组肝脏和肺脏棘球蚴原头节，每组原头节样品称取0.05 g在液氮中将样本研成粉末后转至离心管中，加入裂解液(含1 mmol/L的PMSF、2 mmol/L的EDTA)混匀，置于冰上5 min后加入终浓度为10 mmol/L的DTT，冰浴超声5 min；25 000 g 4 ℃离心20 min，取上清转入新的离心管中，加入5倍体积冷丙酮沉淀过夜；25 000 g 4 ℃离心20 min，弃上清；加入1 mL冷丙酮，捣碎沉淀，置于-20 ℃ 30 min，25 000 g 4 ℃离心20 min，弃上清；风干沉淀中残余丙酮，加入适量裂解液，捣碎沉淀，混匀冰浴超声5 min；25 000 g 4 ℃离心15 min，取上清用于定量。Bradford法测定蛋白质浓度。每个样品上样量30 μg，Marker上样量10 μg，进行SDS-PAGE电泳检测。

1.3蛋白质酶解 每个样品取出100 μg，按蛋白质∶酶=20∶1的比例加入Trypsin，37 ℃酶解4 h。按上述比例再补加Trypsin 1次，37 ℃继续酶解8 h。

1.4iTRAQ标记 胰蛋白酶消化蛋白质后，用真空离心泵抽干肽段；用0.5 mol/L TEAB复溶肽段，分别用8标iTRAQ 试剂中的 113、114、115、116、117、118、119和121等 4 个标记分子进行标记 (具体操作参照试剂盒说明书) 后等量混合。每一组肽段被不同的iTRAQ标签标记，室温培养2 h；将标记后的各组肽段混合，用SCX柱进行液相分离。

1.5基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析 将抽干的每个组分分别用buffer A (5% ACN, 0.1% FA) 复溶至约0.5 μg/μL的浓度，20 000 g离心10 min，除去不溶物质。每个组分上样5 μL(约2.5 μg蛋白)，通过岛津公司LC-20AD型号的纳升液相色谱仪进行分离。

1.6蛋白数据库搜索 采用Mascot 2.3.02蛋白质鉴定软件进行蛋白数据库搜索。

2 结 果

2.1各样本蛋白质提取浓度和提取量 提取的各组原头节总蛋白质经Bradford定量，其原头节蛋白质浓度及得到的总蛋白质量如表1所示，得到的各组蛋白质量满足SDS-PAGE及ITRAQ蛋白分析的用量。

表1 肝脏和肺脏各样本原头节蛋白质浓度及提取量

2.2各样本蛋白质SDS-PAGE电泳胶图 各原头节样本总蛋白质行SES-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色后蛋白质表达谱如图1所示，各样本蛋白质条带在35～45 kDa之间有差异，尤其是肝4的样本大约在55 kDa处蛋白质浓度高。

M：蛋白质标记物；L-P表示肺脏原头节；H-P表示肝脏原头节；1、2、3、4表示第1组，第2组，第3组，第4组

2.3质谱检测结果 标记好的肽段经 SCX 分离及 C18 除盐后用 ESI-Q-TOF 质谱仪进行质谱分析，检测方式：正离子，扫描范围：50～3 000 m/z，利用 Mascot (http: //www.matrix science. com/search_form_select.html) 软件对蛋白质进行定性及定量分析，通过实验中所得到的质谱数据与生物信息学数据库比对得到蛋白质定性及定量结果，共获得与棘球绦虫匹配的肽段1 229个，其中2段以上不同肽段覆盖的蛋白266个，占全部鉴定蛋白的93.99%；5段以上不同肽段覆盖蛋白179个，占全部鉴定蛋白的63.25%；10段以上不同肽段覆盖的蛋白86个，占全部鉴定蛋白的30.39%，蛋白分离和鉴定结果均较好。这一结果表明采用iTRAQ试剂标记结合液相色谱串联质谱技术可以实现对寄生于青海省青南地区绵羊肝脏和肺脏细粒棘球绦虫棘球蚴原头节蛋白质组的有效分离和鉴定，图2为每组寄生于肝脏与肺脏原头节的差异蛋白质数量。

(红色代表上调，绿色代表下调)

2.4生物信息学分析及功能注释 实验所得质谱数据wiff文件通过ProteinPilot 3.0软件检索SwissProt数据库 (090303.fasta)，种属选择为sheep。使用Cluster3.0软件进行分层聚类分析蛋白的表达模式。本研究运用集分析算法对初步鉴定的1 159个蛋白质数据进行分组，鉴定的蛋白质与数据库进行比对，选择GO的生物过程、细胞成分和分子功能注释对蛋白质进行分类、注释。参与免疫系统的蛋白质有141个，参与代谢的蛋白质有441个，参与信号转导的蛋白质有180个，还有一些蛋白质参与物质转运、细胞周期等，部分差异表达的蛋白质如表2所示。

2.5蛋白质功能聚类分析 通过GO注释对蛋白功能进行聚类分析，通过对寄生在绵羊肝脏和肺脏细粒棘球绦虫原头节差异蛋白进行KEGG通路和GO分析对参与各类生物过程的1 229个蛋白质进行富集度分析，结果显示代谢相关蛋白质以及应激反应、细胞骨架合成、基因表达翻译和发育相关的蛋白质在原头节中显著富集(图3)，这些蛋白质归属于5个生物过程，分别是：生物系统、新陈代谢、遗传信息过程、环境信息过程和细胞系统 (图4)。

表2 部分绵羊肝脏及肺脏细粒棘球蚴原头节显著差异表达的蛋白质

图3 显示差异蛋白质GO富集蛋白质分布图

图4 蛋白质KOG功能分类

3 讨 论

蛋白质在细胞中有多种功能，它是细胞信号传导、形态结构维持、胞内物质代谢等生理功能的执行者，搞清楚包虫囊形成机制为包虫病的防治带来指导性作用。细粒棘球绦虫虫卵进入中间宿主后发育形成囊的过程是一个复杂的过程[8]，棘球蚴囊的形成过程：虫卵-六钩蚴-棘球蚴囊，六钩蚴到底是怎么空泡化发育为囊泡，再形成由外向内的角皮层、生发层及囊内含物这是一个关键问题，此过程中必定有众多的蛋白质参与包虫囊形成过程，也有蛋白质参与了寄生虫的免疫逃避等生物过程[9]。

付世强等[10]分析绵羊肝脏、肺脏细粒棘球蚴原头节miRNA表达特征时发现在绵羊肝脏和肺脏分别有94条和88条miRNA 特异表达，这些特异表达的miRNA可能与棘球蚴的寄生部位不同有关。既然发现不同部位寄生原头节表达的基因有差异，那么可以推测基因表达的蛋白质表达也会有差异。Cui SJ等[11]运用2D和LC-MS技术在绵羊肝脏细粒棘球绦虫原头节以及犬小肠内成虫共鉴定出1 610个蛋白质，大部分是绑定蛋白和具有催化活性的蛋白质，390个来自绵羊原头节蛋白质中至少有339个是新鉴定的。本研究运用SDS-PAGE确定差异蛋白质大约分布在35～55 kDa范围之间，利用iTRAQ和LC-MS/MS技术对肝脏原头节与肺脏原头节的蛋白质进行ITRAQ蛋白质组比较分析共分离鉴定出1 229个蛋白质，发现了217个差异蛋白质，74个蛋白质表达在肝脏原头节中上调，143个蛋白质表达在肝脏原头节中下调，还发现了多个未鉴定的新蛋白质，推测可能是原头节在不同部位寄生时所处的环境不同导致其蛋白质表达发生不同。

本研究只是得到了绵羊肝、肺组织中棘球蚴原头节蛋白质表达谱，但靶蛋白的调控及靶蛋白与免疫应答及虫体的发育机制仍需进一步明确。本研究中发现铁蛋白是一个有意义的下调差异蛋白质(蛋白质质量：24.5 kDa，有5个独特肽，肝肺比值：0.35)，且众多研究表明如肝癌[12]、脂肪肝[13]、肝炎[14]等肝脏疾病与铁蛋白表达异常紧密相关，并且由于铁蛋白独特的结构和特性，其已成为药物治疗的研究热点之一。棘球蚴寄生在肝脏引起的肝包虫病也是一种肝脏疾病，故研究铁蛋白的功能及其在肝棘球蚴病中的作用机制，对预防和治疗肝包虫病有着极其重要的意义。后续研究将从铁蛋白与棘球蚴的生长发育关系、钙离子代谢、纤维化等方面进行，希望能够发现细粒棘球蚴原头节在绵羊肝脏和肺脏生长发育与铁蛋白的相关性，为动物中间宿主包虫病的分子防治提供实验依据和思路。

利益冲突：无