外加碳源和氮源对酸化水稻土温室气体释放的影响

朱春权 韦翠珍 曹小闯 朱练峰 孔亚丽 金千瑜 张均华*

（1中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室，杭州310006；2 淮河水资源保护科学研究所，安徽蚌埠233001；第一作者：zhuchunquan@caas.cn；*通讯作者: zhangjunhua@caas.cn）

全球约有39.5 亿hm2酸性土壤，占潜在可耕地面积的40%～50%[1]。我国酸性土壤广泛分布在东南部热带、亚热带地区，面积多达218 万km2，约占全国陆地面积的22.7%[2]。中国南方水稻田多为酸性土壤。土壤酸化导致土壤板结，质地粘重，土壤结构遭到破坏，通气性变差，养分失调，肥力变差，从而限制作物的养分吸收，降低作物产量[3]。

温室气体已经对环境造成明显的负面影响[4]，其中氮氧化物（Nitrogen Oxide，NOx）是温室气体的重要组成成分[5-6]，它包含如氧化亚氮（N2O）、一氧化氮（NO）和二氧化氮（NO2）等在内的多种化合物。土壤是生态系统NO 产生的重要来源[7]。其中土壤微生物在土壤NO 等温室气体释放过程中发挥着重要作用，包括硝化反应和反硝化作用在内的微生物活动均可产生温室气体NO 和N2O[8]，并且进一步酸化土壤，从而影响植物的生长。

南方酸化土壤作为我国亚热带地区的主要土壤资源，其对温室气体NO 和N2O 的释放需要重点研究。前人对安徽郎溪的耕地酸化土壤进行了3 种不同氮源（尿素、硫酸铵和碳酸氢铵）的施加试验后发现，3 种化学氮肥均能显著刺激土壤的硝化反应，从而进一步降低土壤的pH 值[9]。对湖南祁阳长期定位试验站的酸化土壤进行分析后发现，与不施加任何肥料的酸化土壤相比，长期施加氮磷钾肥以及有机肥料的土壤N2O 的释放显著增加[10]。由此可见，虽然酸化土壤拥有较低的pH 值，但其仍然存在硝化和反硝化作用，并且施加肥料后，其硝化和反硝化作用进一步增强，从而扩大氮氧化物的释放以及刺激土壤进一步酸化。虽然前人的研究关注到了微生物在氮氧化物释放中的作用，但是仅限在施肥后微生物丰度和群落的变化，并未直接关注微生物变化后对土壤温室气体释放的影响。因此，本试验选择了浙江富阳酸化水稻土，单独施加硫酸铵和同时施加硫酸铵以及葡萄糖，进行短期和长期培养后观察氮氧化物的释放以及微生物丰度的变化，以进一步确认微生物本身对酸化水稻土硝化和反硝化的作用。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤样品采集于浙江富阳常耕水稻土（0～20 cm）深度。土样经风干、磨细过2 mm 孔径筛后备用，具体土壤性质见表1。

1.2 试验设计

设置不施氮（CK）与施N 250 mg/kg 2 个氮施用水平，250 mg/kg 氮施用水平又分为单独施加硫酸铵（N）和同时添加硫酸铵及100 mg/kg 葡萄糖（N+C）2 个处理组，各处理均设3 个重复。处理过程如下：称取50 g风干土壤置于250 mL 的广口瓶中，通过滴加超纯水使其含水量达到田间持水量的40%，用无菌透气封口膜封闭瓶口。在25℃黑暗条件下预培养1 周。然后配置相应的硫酸铵和葡萄糖溶液，滴加到预培养的土壤中，施用的量分别为250 mg/kg N 和100 mg/kg C，并且土壤的最终含水量维持在田间持水量的60%。用无菌透气封口膜封闭瓶口，25℃黑暗条件下培养。每隔1 周补充水分，使其保持恒定的含水量。在培养的第2 d 和120 d 测定NO 和N2O 释放后进行破坏性取样，用鲜土提取土壤DNA 以及测定土壤无机氮（NH4+和NO3-）含量，然后将土壤样品风干、过筛待用。

表1 土壤基本理化性质

表2 本试验中使用的引物序列

1.3 测定项目及方法

1.3.1 NO 及N2O

土壤NO 和N2O 释放速率的测定采用静态箱法[4]，其基本过程如下：装有土壤样品的广口瓶用橡胶塞密闭1 h，橡胶塞同时带有上进气管和出气管，管口用气垫进行封闭。1 h 后用10 mL 注射器抽取密闭气体，用气相色谱仪（Agilent 7890，California，USA）测定 N2O 含量。与此同时，打开瓶盖放气后再次封闭瓶口，1 h 后用氮氧化物测定仪直接测定NO 含量，测定时同时打开出气管与进气管，出气管与氮氧化物分析仪相连，记录NO 的数值，测定时间一般为NO 的数值上升后下降至测定前数值为止。

N2O 和NO 的测定结果均换算为nmol/kg/h。

1.3.2 土壤理化性质

土壤 pH 值 采用复合电极法测定（V 土∶m 水=1∶2.5）。土壤 NH4+和 NO3-用 2 mol/L 的 KCl 以 1∶10 浸提后，采用连续流动分析仪（San++System，Netherlands）测定。

1.3.3 土壤微生物丰度

土壤总DNA 的提取使用提取试剂盒 FastDNA®SPIN Ki（tMP Biomedicals，Santa Ana，CA），提取步骤按其说明书进行。提取后的DNA 用nanodrop 测定浓度，然后分别稀释成10 ng/μL 待用。

本试验选取了细菌的16S rRNA 基因[11]、氨氧化细菌和氨氧化古菌的氨单加氧酶（amoA）基因[12]、反硝化细菌的亚硝酸还原酶基因（nirK 和nirS）[13-14]以及一氧化二氮还原酶基因（nosZ）[14]进行定量分析。试验体系为5 μL SYBR Green（Takara Bio, Inc., 日本），0.2 μL 正向引物，0.2 μL 反向引物，1 μL DNA 模板和 3.6 μL 灭菌水，总计10 μL。配制好的体系，在荧光定量PCR 仪（Light Cycler 480 II, Roche, Switzerland）上进行扩增。同时用连接相应基因片段的PMD-18T 质粒进行梯度稀释后做标准曲线[15]。相关基因的引物以及反应条件见表2。

1.4 统计学分析

每个试验重复3 次，用SPSS 软件进行单因素方差分析，平均值用Tukey 法进行多重比较。相关性分析采用pearson 双尾检验分析法。

2 结果与分析

2.1 土壤 pH 值、NH4+-N 和 NO3-N 含量变化

添加硫酸铵后水稻土pH 值显著下降（0 d），其原因在于硫酸铵属于酸性肥料。短期培养（2 d）后pH 值进一步下降，并且施加硫酸铵和同时施加硫酸铵与葡萄糖的2 个处理组间pH 值变化无显著差异（图1）。长期培养（120 d）进一步降低了土壤pH 值，并且同时施加硫酸铵与葡萄糖处理组的pH 值显著小于单独施加硫酸铵的处理（图1）。

添加硫酸铵、硫酸铵与葡萄糖后，短期培养和长期培养下，土壤NH4+-N 含量和NO3--N 含量均显著增加；随着培养时间的延长，土壤NH4+-N 含量显著降低，土壤NO3--N 含量显著增加，并且同时施加硫酸铵和葡萄糖处理组的NH4+-N 降低程度和NO3--N 含量增加程度均显著大于单数施加硫酸铵处理组（图2）。说明外加碳源可以显著促进土壤中氮肥的转化。

表3 相关性分析

图1 处理2 d 和120 d 后土壤pH 值变化

图 2 处理 2 d 和 120 d 后土壤（A）NH4+和（B）NO3-含量的变化

图 3 处理 2 d 和 120 d 后土壤（A）NO 和（B）N2O 释放

2.2 土壤NO 和N2O 释放速率

短期培养和长期培养下，外源施加硫酸铵后均显著促进土壤NO 和N2O 的释放，并且外源添加葡萄糖后进一步提高了NO 和N2O 的释放速率（图3）。说明外加碳源显著促进施氮土壤中温室气体的产生。

2.3 土壤微生物丰度变化

从图4A 可见，外源添加硫酸铵短时间内（2 d）就显著增加土壤中细菌（16s rRNA）的丰度，并且随着培养时间的延长（120 d），土壤细菌的丰度进一步增加；外源添加葡萄糖后，进一步增加了土壤中的细菌丰度。

图 4 处理 2 d 和 120 d 后土壤（A）总菌、（B）厌氧氨氧化细菌、（C）氨氧化细菌和反硝化细菌、（D）nirK 基因、（E）nirS 基因和（F）nosZ基因丰度变化丰度的变化

氨氧化古菌（bacteria - amoA）和氨氧化细菌（bacteria - amoA）均催化铵态氮向硝态氮的转化，并在此过程中产生NO 和N2O。研究结果显示，添加硫酸铵后短时间培养（2 d）就显著提高土壤中氨氧化古菌和氨氧化细菌的丰度，并且在长期培养（120 d）后进一步提高了两种菌的丰度（图4 B 和图4 C）。短期培养（2 d）时，同时施加硫酸铵和葡萄糖的处理氨氧化细菌丰度大于单独施加硫酸铵处理组；长期培养（120 d）时，同时施加硫酸铵和葡萄糖处理组的氨氧化古菌丰度大于单独施加硫酸铵处理组，说明添加葡萄糖后，氨氧化细菌和氨氧化古菌分别在短期培养和长期培养时发挥作用，从而导致不同量的NO 和N2O 释放。

土壤中反硝化细菌促进NO3-向NO 的转变（nirK，nirS）并最终转化为N（nosZ）。研究结果显示，添加硫酸铵后短时间培养（2 d）就显著提高土壤中nirK 和nirS基因的丰度，并且在长期培养（120 d）后进一步提高了nirK 和nirS 基因的丰度（图4 D 和图4 E）。短期培养（2 d）时，同时施加硫酸铵和葡萄糖处理组的nirK 和nirS 基因丰度大于单独施加硫酸铵处理组，长期培养（120 d）时，同时施加硫酸铵和葡萄糖处理组的nirK 基因丰度大于单独施加硫酸铵处理组。添加硫酸铵和同时添加硫酸铵和葡萄糖虽然在短期培养时增加了nosZ基因的丰度，但是在第120 d 时nosZ 基因丰度没有进一步增加，甚至出现显著下降（图4F），从而阻止了NO向N 的转化，最终导致了NO 的积累。

2.4 相关性分析

相关性分析发现，温室气体NO 和N2O 的释放与氨氧化细菌（bacteria-amoA）、氨氧化古菌（arch-amoA）和反硝化细菌中的nirK 和nirS 基因丰度呈极显著正相关。总菌16S rRNA 基因丰度的变化与氨氧化细菌、氨氧化古菌和反硝化细菌丰度变化呈极显著正相关。

3 讨论

3.1 酸化水稻土NO 及N2O 气体释放特征

前人研究表明，土壤中NO 的释放与土壤基质中的无机氮（NH4+和NO3-）含量和净硝化速率密切相关，如VELDKAMP 等在对23 种农田生态系统的研究中发现，NO 释放的量和土壤无机氮含量之间存在显著的正相关。STARK 等[16]在对9 种温带森林和牧场的土壤进行研究后也得出类似的结论。与前人的研究一致，本试验在添加外源硫酸铵后，试验土壤的温室气体NO 和N2O 释放速率均显著上升，远高于对照组（图3）。土壤的无机氮是土壤中硝化细菌以及反硝化细菌代谢活动的底物，而土壤生物源NO 的产生正是这两类细菌活动的结果[17]。因此，外源施加氮可显著增加温室气体NO 或N2O 的产生。本试验结果显示，单独施加硫酸铵和同时施加硫酸铵和葡萄糖处理组的NH4+离子含量，均随培养时间的延长而减少，同时，NO3-离子含量随培养时间的延长均相应上升（图2），说明其中微生物的硝化或反硝化作用对土壤的氮源进行了转化，并在转化过程中产生了温室气体。

在土壤微生物对土壤铵态氮进行利用的过程中，土壤的pH 值会发生显著变化。本研究结果显示，2 个处理的pH 值均随着培养时间的延长而显著下降（图1）。单独施加硫酸铵以及同时施加硫酸铵和葡萄糖的处理pH 值在第2 d 即显著下降。原因在于硫酸铵是一种酸性肥料，由于其本身的酸性作用，导致土壤的pH值下降，但是后期土壤pH 值进一步下降的原因则是其中硝化或反硝化作用导致NH4+离子氧化，在土壤中留下 H+。

土壤的pH 值是影响土壤硝化和反硝化作用的决定因素之一[18-20]。微生物的硝化反应主要发生在通气良好并且pH 值大于4.0 的土壤中。REMDE 等研究发现，在碱性土壤（pH 值7.8）中，NO 主要是由硝化反应产生的，在酸性土壤（pH 值 4.7）中，NO 主要是由反硝化作用产生的。过高或者过低的土壤pH 值都会影响土壤的硝化反应，从而减少NO 等温室气体的释放[12]。JIANG 等[19]研究也发现，pH 值还是决定水稻土硝化过程中起主导作用的菌类的决定因素之一，即在酸性水稻土中，土壤的硝化反应主要由氨氧化古菌主导，而在碱性水稻土中，土壤的硝化反应主要由氨氧化细菌主导。本次试验采用的土壤来自于酸化水稻土，暗示氨氧化古菌可能在原始酸化水稻土通过硝化反应产生温室气体过程中发挥重要作用。

3.2 细菌丰度与NO 和N2O 释放

土壤NO 和N2O 的产生主要通过土壤微生物对其中氮素的转化产生，其中硝化和反硝化细菌是NO 和N2O 的主要产生者[21]。土壤中硝化细菌将NH4+氧化成NO3-离子，反硝化细菌把NO3-最终还原成N2，在硝化和反硝化过程中产生NO 和N2O。土壤微生物的硝化作用包括自养硝化作用和异养硝化作用[22]。在通气良好的土壤中，自养硝化作用是NO 气体释放的主要来源[7，23]；而在低pH 即酸性环境中，异养硝化作用在NO 产生中发挥重要作用。同时，在通气较差的土壤中，反硝化作用将发挥主要作用，将NO3-或NO2-还原为N2或中间产物NO 和N2O[24]。本试验的相关性分析表明，NO 和N2O的释放均与氨氧化细菌、氨氧化古菌以及反硝化细菌的中的nirK 和nirS 基因丰度呈显著正相关，说明本试验外源添加氮源后的温室气体释放主要是由于硝化及反硝化作用产生的。

前人的研究表明，加入葡萄糖后能增加土壤N2O排放，这可能在于葡萄糖的加入为土壤微生物还原NO3-提供了碳源[25]。本试验研究结果与前人一致，即同时施加硫酸铵和葡萄糖处理的温室气体释放在短期培养和长期培养后均显著大于单独施加硫酸铵处理组（图3），说明外加碳源显著增加酸化水稻土温室气体的释放。在短期培养时，温室气体的释放和氨氧化古菌、反硝化细菌中的nirK 和nirS 基因的丰度变化一致，说明短期培养时外加碳源提高土壤温室气体释放主要通过氨氧化古菌和反硝化作用进行。在长期培养后，随着微生物丰度的变化，温室气体释放的趋势主要与氨氧化细菌和反硝化细菌中的nirS 基因的丰度一致，同时nosZ 基因的丰度显著下降，抑制了NO 转化成N2，说明长期培养时添加碳源提高的温室气体主要是通过提高氨氧化细菌和反硝化作用进行的。

相关性分析表明，本试验中氨氧化细菌和氨氧化古菌的基因丰度变化与反硝化细菌中nirK 和nirS 基因的丰度存在极显著相关，说明外源施加氮源后，随着硝化作用的进行，进一步带动反硝化作用，从而最终产生温室气体。

4 结论

单独施加硫酸铵和同时施加硫酸铵和葡萄糖均可通过提高硝化和反硝化细菌的丰度来增加温室气体NO 和N2O 的排放，并且在短期培养和长期培养过程中，外加碳源主要通过调控不同的细菌种类产生温室气体。本研究结果为解释酸化水稻土温室气体排放机制提供了理论支持，为进一步研究全球温室化过程提供了理论基础，比如解释秸秆（可作为外源碳源）还田过程中稻田温室气体释放的机制等。