卤代羟基烷类吸入用麻醉剂对血液中乙醇含量检测的影响

谢冰，闫文静，孟宪跃，苗鑫刚，于峰，董玫，施妍，向平，马春玲，文迪

（1.河北医科大学法医学院 河北省法医学重点实验室 河北省法医分子鉴定协同创新中心，河北 石家庄050017；2.河北黄骅法医鉴定中心，河北 黄骅 061100；3.石家庄市公安局交通管理局，河北 石家庄050091；4.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

采用顶空气相色谱法进行血液中乙醇含量检测时，与乙醇或内标具有相似色谱行为的化合物可对检测形成干扰，尤其是采用气相色谱单柱单检测器进行检测时，无法对假阳性结果进行有效甄别[1]。以往研究[2]发现，卤代羟基烷类吸入用全身麻醉剂与醇类的色谱行为相似。同时，由于在交通事故中，肇事者或受害者血液样本经常在医疗抢救或全麻手术过程中（后）提取，从而导致酒驾或醉驾的误判。本研究采用顶空气相色谱双柱双检测器确认法分析卤代羟基烷类吸入用全身麻醉剂地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷，观察4种麻醉剂对顶空气相色谱法检测血液中乙醇含量的影响，并比较J&W DB-ALC1/DB-ALC2和KBBAC1/KB-BAC2双柱系统的检测效果。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷对照品（纯度均大于99.0%）均购自北京百灵威科技有限公司，乙醇对照品（含量不小于99.5%）购自美国Thermo Fisher公司，叔丁醇购自北京DiKMA公司，实验用水均为Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）制备的超纯水。

1.2 主要仪器

7890A气相色谱仪（美国Agilent公司），7694E顶空进样器（美国Agilent公司）。J&W DB-ALC1石英毛细管气相色谱柱（30 m×0.32 mm，1.8 μm，美国Agilent公司），J&W DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱（30m×0.32 mm，1.2 μm，美国Agilent公司），KB-BAC1石英毛细管气相色谱柱（30 m×0.32 mm，1.8 μm，北京科瑞迈科技有限责任公司），KB-BAC2石英毛细管气相色谱柱（30 m×0.32 mm，1.2 μm，北京科瑞迈科技有限责任公司）。

1.3 溶液配制

麻醉剂标准溶液：准确称取地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷对照品0.1 g溶于10 mL二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）中，然后取 10 μL添加至50mL超纯水中，充分涡旋振荡混匀后超声10min。

乙醇标准品储备液：准确称取1.005 g乙醇对照品置于100 mL容量瓶中，添加纯水至100 mL，混匀，得1 g/100 mL乙醇标准品储备液。试验中所需浓度的乙醇标准溶液可从上述乙醇标准储备液稀释而得。

叔丁醇内标储备液：准确称取4.02 g叔丁醇对照品置于100 mL容量瓶中，添加纯水至100 mL，混匀，得4 g/100 mL叔丁醇内标储备液。使用时，准确量取1mL叔丁醇内标储备液置于1000mL容量瓶中，添加纯水至1 000 mL，混匀，获得4 mg/100 mL叔丁醇标准使用液，分装后置4℃冰箱中保存。

1.4 样品前处理

取0.5mL的叔丁醇标准使用液加入顶空瓶内，再加入0.1 mL待测样品，封口钳将其迅速密封，混匀后置于顶空进样器内加热待检。

1.5 顶空气相色谱分析条件

参照《生物样品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇和正丁醇的顶空-气相色谱检验方法》（GA/T 1073—2013）[3]（以下简称《方法》）中的仪器分析条件，采用顶空气相色谱法对血液中常见卤代羟基烷类吸入用全身麻醉剂地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷进行检测。顶空进样器加热箱炉温65℃，定量环温度105℃，传输线温度110℃，样品瓶加热平衡时间10 min。检测器为氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）（美国 Agilent公司），柱温40℃，检测器温度250℃，进样口温度150℃，载气流速8mL/min，燃气（氢气）30mL/min，空气400mL/min，尾吹（氮气）25mL/min。

1.6 不同色谱条件对分离效果的影响

使用J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱，固定载气流速为8 mL/min，在柱箱温度分别为40℃、50℃和60℃的条件下，观察其对七氟烷、恩氟烷、乙醇和叔丁醇的分离效果。此外，固定柱箱温度为50℃，在载气流速分别为6、4和2mL/min的条件下，观察其对七氟烷、恩氟烷、乙醇和叔丁醇的分离效果。

1.7 不同色谱柱体系抗干扰能力的比较

使用KB-BAC1/KB-BAC2石英毛细管气相色谱柱检测4种卤代羟基烷类吸入性全身麻醉剂，并检测在该色谱条件下4种卤代羟基烷类吸入性全身麻醉剂对血液中乙醇含量检测的影响。

2 结 果

2.1 地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷的检测（顶空气相色谱双柱确认法）

参照《方法》[3]中的仪器分析条件，首先使用7890A气相色谱仪、7694E顶空进样器和J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱对地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷进行分析。如图1所示，上述4种卤代吸入性全身麻醉剂均具有较好的响应，色谱峰型良好，在J&W DB-ALC1石英毛细管气相色谱柱中的保留时间分别为0.909、1.232、1.373、1.533 min；在J&W DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱中的保留时间分别为0.891、1.184、1.426、1.548min。

图1 地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷应用J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱分析的色谱峰Fig.1 Chromatographic peaks of desflurane，sevoflurane，isoflurane and enflurane analyzed by J&W DB-ALC1/DB-ALC2 quartz capillary gas chromatographic column

2.2 地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷对血液中乙醇含量检测的影响

依据《方法》[3]中的仪器分析条件，使用7890A气相色谱仪、7694E顶空进样器和J&W DB-ALC1/DBALC2石英毛细管气相色谱柱进行血液中乙醇含量分析。如图2所示，乙醇和内标叔丁醇在J&W DB-ALC1石英毛细管气相色谱柱的保留时间分别为1.118、1.607min，在J&W DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱的保留时间分别为1.211、1.614min。将地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷与乙醇和叔丁醇混合后进行检测，结果发现：在J&W DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱系统中，七氟烷与乙醇的保留时间基本一致，无法分离和定性甄别，恩氟烷的保留时间与叔丁醇相近，影响了乙醇的定量分析；在J&W DB-ALC1石英毛细管气相色谱柱系统中，七氟烷与乙醇可以有效分离，但恩氟烷的保留时间仍与叔丁醇接近。

2.3 不同色谱条件对七氟烷、恩氟烷、乙醇和叔丁醇的分离效果

使用J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱，通过改变柱箱温度、载气流速参数，以观察其对七氟烷、恩氟烷、乙醇和叔丁醇的分离效果。结果发现，升高柱温后，可一定程度地分离J&W DB-ALC2色谱柱中的七氟烷和乙醇，但在40℃～60℃范围内仍无法完全分离。而在柱温50℃条件下，在2～8mL/min范围内改变载气流速，降低载气流速，可一定程度地分离七氟烷、恩氟烷、乙醇和叔丁醇成分的色谱峰，但是目标物的响应值显著降低，从而降低乙醇的检出限。

2.4 不同色谱柱体系抗干扰能力的比较

此外，本研究还考察了KB-BAC1/KB-BAC2石英毛细管气相色谱柱对4种卤代羟基烷类吸入性全身麻醉剂的检测能力以及在该色谱条件下4种卤代羟基烷类吸入性全身麻醉剂对血液中乙醇含量检测的影响。上述4种卤代羟基烷类吸入性全身麻醉剂均具有较好的响应，色谱峰型良好，在KB-BAC1石英毛细管气相色谱柱中的保留时间分别为1.012、1.544、1.943、2.098 min，在 KB-BAC2石英毛细管气相色谱柱中的保留时间分别为0.766、0.903、0.979、1.065 min。使用该色谱柱进行血液中乙醇含量检测时，乙醇和内标叔丁醇在KB-BAC1石英毛细管气相色谱柱中的保留时间分别为1.566、2.341 min，在KBBAC2石英毛细管气相色谱柱中的保留时间分别为0.933、1.179 min。将地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷与乙醇和叔丁醇混合后进行检测，在KB-BAC1石英毛细管气相色谱柱系统中，七氟烷与乙醇的保留时间相近，色谱峰重合，无法进行定性甄别；在KBBAC2石英毛细管气相色谱柱系统中，七氟烷、异氟烷与乙醇的保留时间均相近，尤其是七氟烷与乙醇的色谱峰基本重合。

图2 乙醇、叔丁醇及4种麻醉剂混标在J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱中的色谱峰Fig.2 Chromatographic peaks of ethanol，tert butyl alcohol and four anesthetics analyzed by J&W DB-ALC1/DB-ALC2 quartz capillary gas chromatographic column

2.5 案例应用

2.5.1 案例1

某女性，某日10：00左右与对向行驶的机动车发生交通事故。要求对事故双方血液中乙醇含量进行检测。参照《方法》[3]中的仪器分析条件，首先使用7890A气相色谱仪、7694E顶空进样器和J&W DBALC1/DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱对血液中乙醇含量进行检测。机动车驾驶员血液中未检出乙醇成分。

对该女性血液进行检测，通过J&W DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱结果（图3）推测乙醇质量浓度为41.46mg/100mL，而J&W DB-ALC1石英毛细管气相色谱柱结果显示，未检出乙醇成分。经案情调查，该女性的血液样本是在手术抢救过程中提取，且J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱中的色谱峰保留时间均与七氟烷一致，故可考虑J&W DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱为七氟烷的干扰。因此，本案中该女性的鉴定意见为“未检出乙醇成分”。

2.5.2 案例2

李某，男，某日22：00左右驾驶机动车发生交通事故。要求对李某血液中乙醇含量进行检测。参照《方法》[3]中的仪器分析条件，首先使用7890A气相色谱仪、7694E顶空进样器和J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱对血液中乙醇质量浓度进行检测。通过J&W DB-ALC1石英毛细管气相色谱柱结果（图4）推测乙醇质量浓度为201.43mg/100mL，而通过J&W DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱结果推测乙醇质量浓度为247.95mg/100mL。通过查阅色谱图，发现J&W DB-ALC1石英毛细管气相色谱柱系统中分别存在乙醇和七氟烷特征色谱峰，而J&W DBALC2石英毛细管气相色谱柱系统中乙醇和七氟烷的色谱峰重合。通过案情调查，李某的血液样本是在手术抢救过程中提取，查阅手术记录发现确有使用七氟烷进行麻醉。故J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛细管气相色谱柱所得结果不一致的原因为七氟烷的干扰。本案应采用J&W DB-ALC1石英毛细管气相色谱柱系统的定量结果。

图3 案例1气相色谱图Fig.3 Gas chromatography of case 1

图4 案例2气相色谱图Fig.4 Gas chromatography of case 2

3 讨论

自醉酒驾驶机动车于2011年纳入刑事犯罪以来，机动车驾驶人员血液中乙醇含量是对该类案件定罪量刑的关键证据。顶空气相色谱法是目前血液中乙醇含量检测技术标准[3]中规定使用的方法。但是，仅通过单柱的保留时间进行定性分析存在较大风险，双柱双检测器确认的方法从一定程度上降低了该方法进行定性分析的风险[4]。本研究观察了4种卤代羟基烷类吸入用全身麻醉剂对血液中乙醇含量检测的影响，并基于两套不同的色谱柱考察了双柱双检测器检测方法的抗干扰能力。结果显示，七氟烷与乙醇的保留时间相近，对乙醇的定性分析存在较大影响，通过J&W DB-ALC1/DB-ALC2双柱双FID检测器系统可予以甄别，改变柱温和载气流速也可一定程度地排除干扰物的影响。恩氟烷对血液中乙醇的定性分析虽无明显影响，但在采用内标法进行乙醇定量分析时，还需通过改变色谱条件，提高分离度以排除恩氟烷的干扰。而KB-BAC1/KB-BAC2双柱双FID检测器系统对七氟烷和乙醇均无法进行有效分离以排除干扰，其他3种卤代羟基烷类吸入性全身麻醉剂对血液中乙醇含量无明显影响，或可通过双柱系统予以解决。吸入用麻醉药物是以气体形式通过呼吸道进入人体内发挥麻醉作用。虽然静脉麻醉药物丙泊酚在临床已得到广泛使用，但由于吸入麻醉药物具有麻醉效能强、可控性高的特点，其在全身麻醉中特别是在成人和儿童全身麻醉的诱导和维持过程中依然占据主导地位[5-6]。目前，卤代羟基烷类挥发性吸入用麻醉药物是目前临床较为常用的吸入用麻醉药物，包括甲氧氟烷、恩氟烷、异氟烷、七氟烷和地氟烷[7]。在本研究提及的2个乙醇含量检测案例中，被鉴定人血液中均检出七氟烷成分，其原因均为手术抢救过程使用了挥发性吸入用麻醉药物七氟烷，且血液样品是在手术过程中采集。通过双柱双FID检测器系统有效地排除了七氟烷的干扰，得到了正确的鉴定意见。值得注意的是，本研究结果发现，双柱双FID检测器系统中所使用的气相色谱柱是该方法的关键因素，即使使用了双柱双FID检测器系统，但如不同气相色谱柱的区分效能不足，则仍然能导致误判的发生。因此，进行深入的案情调查，选择不同的色谱条件确证或采用气相色谱-质谱联用法进行定性分析是得到正确鉴定意见的有效方法。目前，在多数的基层鉴定机构中，多使用单柱单FID检测器进行驾驶人员血液中乙醇含量检测。工作中，由于对案情缺乏细致深入的调查，且分析经验不足，则可能因卤代吸入用全身麻醉剂引起的假阳性结果导致酒驾或醉驾的误判。此外，以往研究[1]还发现丙酮也可能因为与内标叔丁醇的保留时间一致，从而导致定量结果产生较大误差。因此，笔者认为：（1）使用双柱双FID检测器系统进行血液中乙醇含量检测是降低误判发生率的有效方法；（2）交通肇事或乙醇中毒类案件中，血液样品采集过程应予以详细记录，并在实施抢救过程前完成样品采集；（3）不同色谱柱产品的分离效能存在诸多差异，实际工作过程中还应结合案情对文献报道中易产生假阳性的化合物进行考察，必要时应优化色谱条件或通过气相色谱质谱联用法进行定性分析。

综上，本研究探讨了卤代吸入用全身麻醉剂地氟烷、七氟烷、异氟烷和恩氟烷对顶空气相色谱法检测血液中乙醇含量的影响，七氟烷和恩氟烷成分易对乙醇和叔丁醇的色谱行为造成干扰，选择适当的色谱柱进行双柱确认检测可有效予以甄别。该结果对交通肇事类案件血液样本采集过程和血液中乙醇含量检测方法的规范化具有重要意义。