云南汉族CRHBP基因多态性与精神分裂症及其攻击行为的相关性分析

陈阳，胡利平，刘林林，张秀峰，计艾岑，李佳珏，聂胜洁

（1.昆明医科大学法医学院，云南 昆明 650500；2.湖南迪安司法鉴定中心，湖南 长沙 410006）

下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴释放促肾上腺皮质激素释放激素（corticotrophin-releasing hormone，CRH）、促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）和糖皮质激素（glucocorticoid，GC），是应激反应的重要基础。当有害应激持续发生时，CRH功能亢进，皮质醇的水平和活性升高，精神分裂症患者ACTH、CRH水平高于正常对照组[1]，HPA轴急性应激能诱导患者攻击行为，与基底皮质醇负相关[2]。促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白（corticotropin-releasing hormone binding protein，CRHBP）通过与CRH结合影响HPA轴功能，与海马神经元的发育、细胞凋亡等神经行为相关联[3]。但目前有关CRHBP基因多态性与精神疾病及行为的相关性研究尚浅，且主要集中于抑郁症、自杀行为[4-5]。因此，本研究筛选CRHBP基因的4个标签单核苷酸多态性（tag single nucleotide polymorphism，Tag SNP）位点，在云南汉族群体中采用病例对照研究方法对其与精神分裂症及患者攻击行为的相关性进行探讨。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究已获得昆明医科大学伦理委员会的批准，所有受试者或监护人均知情同意。

收集云南省石林县、宜良县无关个体163例为病例组（男性96例，女性67例），其中伴攻击行为（伴打人、骂人、毁物等攻击行为）81例，不伴攻击行为82例。诊断严格按照《精神障碍诊断及统计手册（第4版）》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，the fourth revised edition，DSM-IV）[6]的标准执行，精神行为检查和评估均由云南省精神病医院两位副主任医师及副主任以上职称的专业精神科医生完成。

纳入标准：（1）云南汉族；（2）除烟草和咖啡因外，6个月内未有其他药物滥用史。排除标准：（1）肝肾代谢功能异常；（2）合并明显的躯体疾病、神经系统疾病和其他精神障碍；（3）除烟草和咖啡因外，6个月内有其他药物滥用史；（4）妊娠期或哺乳期妇女。

对照组来自云南省昆明市疾病预防控制中心健康体检的无关个体345例，无精神病史、酒精依赖史、药物滥用史且年满18周岁的健康云南籍汉族个体。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物设计

采用经典酚-氯仿法提取全血基因组DNA。根据HapMap数据库（http://www.hapmap.org/index.html.ja）上中国汉族人群SNP基因分型数据，按照r≥0.8、最小等位基因频率（minor allel frequency，MAF）＞0.1的标准[7]，运用Haploview 4.2（美国Broad公司）筛选出CRHBP基因的4个Tag SNP（rs7721799、rs32897、rs7718461和rs10062367），其野生型等位基因依次为G、T、G、G。引物及连接探针用Primer Premier 5.0（加拿大Premier公司）软件设计（表1）。

表1 4个SNP位点及其引物与探针序列Tab.1 The primers and probe sequences of 4 SNP

1.2.2 复合扩增体系建立

10 μL 扩增体系：5.13 μL 双蒸水（double distilled H2O，ddH2O）、1 μL 10×缓冲液（日本Takara公司）、0.6 μL Mg2+（25 mmol，德国Qiagen公司）、1.2 μL dNTP（2.5mmol，美国Promega公司）、1μL引物混合物（1.0 μmol，上海天昊生物科技有限公司）、0.07 μL HotStarTaq DNA聚合酶（5 U/μL，德国Qiagen公司）、1 μL DNA模板（1～5 ng/μL）。9700型PCR仪（美国Applied Biosystems公司）程序：94℃ 2min；94℃ 20s，65℃（每个循环下降0.5℃） 40 s，72℃ 30 s，循环11次；94℃ 20s，59℃ 30s，72℃ 1min，循环24次。

产物纯化：10 μL PCR产物、1 μL虾碱性磷酸酶（1U/μL，美国NEB公司）、0.05μL核酸外切酶（20U/μL，美国NEB公司），37℃ 1h，75℃ 15min。

1.2.3 改良的多重高温连接酶反应

改良的多重高温连接酶反应（improve multiplex ligase detection reaction，iMLDR）即在Taq DNA连接酶的作用下，当SNP位点上下游两条寡核苷酸探针与目的DNA序列完全互补，且两条探针之间没有空隙时发生连接反应。

10 μL 反应体系：PCR 纯化产物 3 μL、ddH2O 5.15 μL、10×连接酶缓冲液［NEB（北京）有限公司］1 μL、高温连接酶［NEB（北京）有限公司］0.5 μL、通用探针混合液0.25 μL、特异连接探针混合液（1.0 μmol） 0.1 μL。反应程序：94 ℃ 10 min，56 ℃1 min，循环38次。利用3100基因分析仪（美国Applied Biosystems公司）分析，0.5μL连接产物与9.5μL含0.5 μL GeneScan-120Liz内标（美国Applied Biosystems公司）的高度去离子甲酰胺（Highly deionizedformamide，HiDi）混合，95 ℃ 5 min，冰浴3 min。通过GeneMapperIDv3.2（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行数据分析和基因分型。

1.3 统计分析

应用Haploview 4.2进行Hardy-Weinberg平衡检验、连锁不平衡分析。连锁不平衡指的是不同遗传标记间存在着的非随机组合。D’是一个和基因频率无关的连锁不平衡系数，取值范围是0（连锁平衡）到1（完全连锁不平衡，即两个位点间没有发生重组）[8]。SPSS 19.0（美国IBM公司）对基因型、等位基因频率及显隐性遗传模型进行逻辑回归分析，显性模型为野生纯合子vs野生突变杂合子+突变纯合子，隐性模型为野生纯合子+野生突变杂合子vs突变纯合子。应用PHASE 2.1（英国曼彻斯特大学开发）构建单倍型，SPSS 19.0对单倍型频率进行回归分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 单位点分析

各位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。各位点基因型及等位基因频率分布及逻辑回归分析结果显示，rs7718461位点等位基因频率在病例组与对照组、病例组伴攻击行为与病例组不伴攻击行为的分布差异均有统计学意义（P＜0.05），基因型频率在病例组伴攻击行为和病例组不伴攻击行为中的分布差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）；其余3个位点的基因型和等位基因频率在病例组与对照组、病例组伴攻击行为与病例组不伴攻击行为之间分布差异无统计学意义（P＞0.05）。显隐性遗传模型回归分析结果显示，rs7718461的GG或GA基因型携带者伴攻击行为的风险大于AA基因型携带者［P=0.003，比值比（odds ratio，OR）为4.903，95%置信区间（confidence interval，CI）为 1.740～13.814］。

2.2 多位点分析

连锁不平衡分析结果（图1）显示，在云南汉族个体中，病例组与对照组、病例组伴攻击行为与病例组不伴攻击行为各位点之间存在连锁不平衡现象。

单倍型分析结果显示，所有单倍型分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 rs7718461位点基因型及等位基因频率分布Tab.2 Genotype and allele frequency distribution of rs7718461

图1 各组SNP连锁图（D’）Fig.1 Every group’s linkage map（D’）of SNP

3 讨论

有研究结果[1，9]表明，HPA轴相关基因多态性在精神分裂症患者及其攻击行为中可能发挥着重要的作用。CRHBP蛋白与CRH的亲和力比CRHR1和CRHR2更高[8]，由于其细胞特异性和表达复杂性，一方面可能通过抑制CRH的活性降低个体精神障碍的风险，另一方面通过增强CRH的下游信号，可能引发CRH功能亢进导致精神疾病及行为[10]。目前，国内外关于CRHBP基因与精神分裂症患者除自杀以外的攻击行为相关性研究较少。本研究结果显示，在不考虑性别及年龄因素的情况下，CRHBP基因rs7718461位点以外的3个Tag SNP位点与精神分裂症均无关联（P＞0.05）。对rs7718461位点的隐性遗传模型进行逻辑回归分析结果显示，纯合子AA基因型能显著减轻患者攻击行为的风险（P=0.003，OR为4.903，95%CI为1.740～13.814）。根据SHEIKH等[11]研究发现，学龄前儿童CRHBP基因rs10473984和rs32897 GG携带者皮质醇活性显著高于其他基因型携带者。DAVYDOW等[12]研究发现，CRHBP基因rs10055255位点TT携带患者的创伤后应激障碍和抑郁症状明显少于其他两种基因型携带者，ROY等[5]研究发现，同时携带FKBP5基因rs3800373 CC和CRHBP基因rs7728378 CC的童年创伤后个体自杀未遂的案例显著多于携带其他基因型的个体。RIBBE等[13]研究发现，CRHBP基因rs3811939多态性显著影响精神分裂症患者酒精使用障碍，DE LUCA等[9]研究发现，CRHBP基因多态性与精神分裂症患者自杀行为显著相关。本研究结果与上述研究结果均提示CRHBP基因多态性直接或间接地调控基因表达后可能通过CRH与精神分裂症患者行为有一定关系，但精神分裂症作为复杂的多基因遗传疾病，单基因的作用相对较弱，需要进一步分析CRHBP基因和HPA轴上其他相关受体基因的交互作用。另外，急性应激、糖皮质激素、雌激素、促性腺激素释放激素等均能正向调控CRHBPmRNA的表达[10]，性别、年龄、职业等人口分层，高血压和糖尿病等慢性疾病家族病史均可能对分析结果产生影响。因此，进一步扩大样本、优化样本结构，进行多民族、多基因的研究，有利于深入明确CRHBP基因在精神分裂症发病、发展中的遗传机制。然而，由于攻击行为可能没有精神分裂症的遗传机制复杂，而且伴或不伴攻击行为的个体均是精神分裂症患者，体现在样本结构的影响因素分析时可能比精神分裂症的相关性研究更易实施。