丹参滴注液中果糖、丹参酸B含量的检测方法

刘 将， 周 仓

（1.上海华源安徽锦辉制药有限公司，安徽阜阳 236018；2.亳州学院，安徽亳州 236800）

丹参滴注液是中药丹参单方制剂，具有活血化瘀、通脉养心、活血消肿、养血安神等功效.研究表明，丹参具有抗动脉粥样硬化、抑制心肌肥厚、抗心肌缺血、抗心肌纤维化、抗心律失常等作用[1，2].临床用于治疗冠心病、心绞痛、胸中憋闷等疾病.丹参滴注液为丹参药材经纯化水提取、乙醇沉淀除杂的方式配制而成，其有效成分主要是丹酚酸B等水溶性酚酸类成分[3].

丹参滴注液提取工艺中，丹参原材料虽然经过多次水提醇沉，但是其制剂中仍存在单糖和低聚糖，该糖类成分直接影响注射液的渗透压、固含量等参数[4，5].而且丹参原材料在煎煮过程中，丹酚酸B分解转化成了丹参素以及其它酚酸类成分[3]，成品制剂中丹酚酸B的含量相对较低.在现行丹参滴注液质量和工艺要求中，其质量控制主要是控制丹参素钠、原儿茶醛等成分[6]，但是对于丹参滴注液中存在的果糖、丹酚酸B并未做相关要求.糖类成分的检测目前有多种方法，比较常用的有旋光法、电泳法等，虽然获得了较满意的效果[7，8]，但是此类方法对糖类的分离检测效果的专属性不是很好，共存物质会对检测结果产生一定的干扰.

因此建立一种适用于丹参滴注液中果糖、丹酚酸B的检测方法，对该产品工艺的持续性、稳定性、质量可控性均有着积极的意义.为了提高检测的专属性和灵敏度，本项目采用HPLC-RID和HPLC-UV分别对丹参滴注液中果糖、丹酚酸B含量检测进行试验性探析，根据试验情况和制剂特点建立适用性较好的检测方法.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪，安捷伦VWD紫外-可见检测器，RI230型依利特示差折光检测器.

1.2 样品及试剂

果糖标准品（中国食品药品检定研究院，批号：100231-201807，纯度99.6%）、丹酚酸B标准品（中国食品药品检定研究院，批号：111562-201716，纯度94.1%）、乙腈（色谱纯，国药），冰醋酸（色谱纯，国药），三乙胺（分析纯，国药）.

丹参滴注液（上海华源安徽锦辉制药有限公司，批号：18120501、18120502、18120503）.

2 方法与结果

2.1 HPLC-RID法检测丹参滴注液果糖含量

2.1.1 色谱条件

图1 果糖定性HPLC图 [A：果糖对照品；B丹参滴注液]

图2 葡萄糖定性HPLC图 [A：葡萄糖对照品；B丹参滴注液]

经过前期试验探索，在保证分离度等试验要求下，最终确定以下色谱条件：

色谱柱：Phecda-NH2氨基柱（250×4.6 mm，5 μm，江苏汉邦科技有限公司）.示差折光检测器：通用型（RID）.柱温：30 ℃.流速：1.0 mL/min.进样量：20 μL.流动相：乙腈：水：三乙胺 =75：25：0.5.

在上述条件下，图谱前期的试剂峰与主峰分离度较好，与果糖峰相邻的葡萄糖峰（相同色谱条件下葡萄糖定性HPLC图见图2）分离也较好.为了确保定量分析的准确，要求果糖理论塔板数不得低于3 000.果糖定性HPLC图见图1.

2.1.2 果糖对照品溶液精密度试验

精密称取果糖对照品200.74 mg，加入到10 mL容量瓶中，取该溶液5 mL移至10 mL容量瓶中，定容后平行进样6针，根据峰面积计算精密度，RSD为0.83%，试验精密度较好，符合试验相关要求规定.

2.1.3 果糖对照品溶液稳定性试验

将上述对照品溶液每2 h进样一次，平行6次，根据图谱计算RSD为0.69%，在10 h内的稳定性较好，符合试验要求规定.

2.1.4 果糖对照品标准曲线绘制

果糖标准品逐级稀释法分别配成6个梯度对照品溶液，各浓度对照品溶液分别进样20 μL，每个浓度进样2次，分别测定含量，制备标准曲线，得果糖回归方程：Y=203.98X-9.8267（R2=0.9999）. 果糖浓度在 0.6273～20.0740 mg/mL之间呈良好的线性关系.

2.1.5 果糖对照品溶液灵敏度试验

精密量取标准曲线中0.6273（mg/mL）对照品溶液，稀释10倍，作为灵敏度检测用溶液.试验结果表明，果糖浓度与检测信号的比值约为5，当果糖进样量为10 μg时（20 μL），对应出现色谱峰面积约为 2.7，峰型及分离较好，表明该检测条件对于果糖微量检测时灵敏度较低且检测下限较小.

2.1.6 供试品溶液稳定性试验

取制剂供试品溶液，分别于 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h各进样一次，根据图谱显示计算供试品溶液中果糖RSD为0.55%，符合试验要求.结果表明，在试验室条件下，供试液中果糖在10 h内未发生降解和衍生情况，基本稳定.

2.1.7 供试品溶液回收率试验

取供试品溶液（批号：18120501）5 mL，共平行6份，加入10 mL容量瓶中，再分别加入果糖对照品溶液（8.021 mg/mL）1.5、1.5、2.0、2.0、2.5、2.5mL，定容，摇匀并进样检测，得果糖平均回收率为100.15%，RSD为0.77%，符合要求，结果见表1.

2.1.8 丹参滴注液果糖含量测定

依据上述检测方法对3批丹参滴注液制剂（250 mL/瓶）中的果糖含量进行检测.三批18120501、18120502、18120503丹参滴注液中的果糖检测结果分别为633.68、643.50、640.75 mg/瓶，平均含量为 639.31 mg/瓶.

2.2 HPLC-UV法对丹参滴注液制剂丹酚酸B含量进行检测

2.2.1 色谱条件

经过前期试验探索，在保证分离度等试验要求下，最终确定以下色谱条件：

色谱柱：安捷伦 C18（250×4.6 mm，5 μm）.检测波长：281 nm.柱温：30 ℃.流速：1.0 mL/min.流动相：乙腈-0.5%冰醋酸（28：72）为流动相.理论塔板数大于5 000.

在上述色谱试验条件下丹酚酸B分离度及峰型较好，能够将制剂中丹酚酸B同其他成分进行较好分离.丹酚酸B定性HPLC图见图3.

表1 供试品溶液回收率试验

图3 丹酚酸B定性HPLC图（A：丹酚酸B对照品，B：丹参滴注液）

2.2.2 丹酚酸B对照品溶液精密度试验

精密称取丹酚酸B对照品10.80 mg，用50%甲醇定容至25 mL容量瓶中.连续平行进样6次，根据图谱计算峰面积RSD为0.21%，结果表明试验精密度较好.

2.2.3 丹酚酸B对照品溶液稳定性试验

取上述丹酚酸B对照品溶液，隔2 h测一次，共6次，6次检测结果几乎无明显变化（RSD为0.37%），表明对照品丹酚酸B溶液在10 h内稳定.

2.2.4 丹酚酸B对照品标准曲线制备

将上述丹酚酸B对照品溶液（43.2 μg/mL），用50%甲醇分别稀释至 21.6 μg/mL、10.08 μg/mL、5.4 μg/mL、2.7 μg/mL的溶液，每个浓度进样2次，分别测定含量，制备标准曲线，得回归方程：Y=10.62X+0.5042（R2=1.0000），丹酚酸B浓度在2.7～43.2 μg/mL之间呈良好的线性关系.

2.2.5 供试品溶液稳定性试验

取丹参滴注液制剂（批号：18120501），制备供试品溶液，分别于 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 各进样一次，计算得RSD为2.34%，说明室温条件下10 h内丹参滴注液中丹酚酸B是稳定的，符合实验要求.

2.2.6 供试品溶液回收率试验

精密量取已测定含量的制剂（批号：18120501）共6份，精密量取各5 mL，置10 mL容量瓶中，分别加入丹酚酸 B 对照品（43.2 μg/mL） 溶液 1.2、1.2、1.5、1.5、1.8、1.8 mL，再分别加甲醇定容至刻度，摇匀，依法测定.得果糖平均回收率为100.3%，RSD为1.51%，符合要求，结果见表2.

表2 供试品溶液回收率试验

2.2.7 丹参滴注液制剂中丹酚酸B含量测定

依据上述方法对 18120501、18120502、18120503 批次丹参滴注液制剂进行检测.三批制剂丹酚酸B含量分别为 3.21 mg/瓶、3.29 mg/瓶、3.07 mg/瓶.

3 讨论

上述试验采用HPLC-RID法检测丹参滴注液中果糖含量的方法（色谱条件：色谱柱Phecda-NH2氨基柱，示差检测器，30℃柱温，1.0 mL/min流速，20 mL进样量，流动相为乙腈：水：三乙胺 =75：25：0.5）和 HPLC-UV 法检测丹参滴注液中丹酚酸B含量的方法（色谱条件：安捷伦C18柱，紫外检测器波长281 nm，30℃柱温，1.0 mL/min流速，20 mL进样量，流动相为乙腈：5%冰醋酸=28：72），优化了丹参滴注液制剂中所含果糖成分、丹酚酸B成分的检测方法，能够进行快速、准确的检测，该两种方法相较于旋光法、电泳法、HPLC-ELSD法专属性更强、灵敏度更高、适用性好，且过程基本控制在10min左右，达到了快速检测的效果，基本能够满足对丹参滴注液果糖、丹酚酸B的中间体和成品检测要求，能有效提高丹参滴注液的质量控制水平，进一步保障药品临床使用的有效性、安全性.