基于网络药理学探讨乳积方治疗三阴性乳腺癌的作用机理

戴黎颖， 陈学彰， 李宏良， 陈锡康， 田华琴

广州中医药大学附属佛山中医院肿瘤中心，广东 佛山 528000

三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均为阴性表达的乳腺癌，易发生术后转移，恶性程度高，预后差。而中医药在乳腺癌的治疗上有独特的优势，如改善生活质量，降低毒副反应以及增强疗效等作用[1]。乳积方(北柴胡、白芍、党参、山慈菇、海藻、瓜蒌、浙贝母、预知子，王不留行）是广州中医药大学附属佛山中医院肿瘤中心用以治疗乳腺癌的经验方。整张方着眼于乳腺癌肝郁气滞、痰毒蕴结的病机特点，从疏肝健脾，清热散结角度进行处方布局。方中柴胡疏肝理气、升举阳气，为君药；配伍白芍合养血柔肝，党参补益肺脾，扶助正气，为臣药；浙贝母、山慈菇、海藻，化痰散结；瓜蒌清热涤痰开胸，预知子疏肝理气、活血止痛；王不留行活血通经，是为佐药[2]。前期研究发现，乳积方制剂对人乳MDA-MB-231细胞具有增殖抑制作用，能增效减毒以及降低乳腺癌术后复发、转移率[3-7]，但乳积方治疗TNBC的作用机制还有待深入研究。

本研究使用网络药理学方法提取、分析乳积方成分、作用靶点和分子通路等，进而探讨乳积方治疗TNBC可能的机制，为研究其作用机制的相关实验研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 乳积方主要化学成分收集

利用中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索乳积方9味中药的化学成分。设定各中药生物利用度(bioavailability，OB）≥30%，类药性(drug-likeness，DL）≥0.18。筛选出各药物有效成分(ingredients），并根据筛选出来的有效成分过滤其对应的靶基因(Related Targets）。

通用蛋白资源(Universal Protein Resource，UniProt，https：//www.uniprot.org）是一个高数据量、高质量的蛋白质序列与功能信息数据库，可将TCMSP中获取的药物靶基因名称转化为UniProt数据库中基因所对应的名称。

1.2 TNBC疾病靶点的筛选

使用在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man， OMIM， http：//omim.org）、Gencards数据库(http：//www.genecards.org）检索“TNBC”以及“Triple negative breast cancer”，获取TNBC疾病基因。

1.3 药物-活性成分-疾病相互作用网络构建

使用R软件“VennDiagram”程序包，取乳积方药物靶基因和疾病靶点的交集，绘制韦恩图；使用Cytoscape(Version3.7.2）制作TNBC-乳积方-活性成分-作用靶点网络。

1.4 构建乳积方-TNBC交集靶点蛋白互作网络

STRING数据库(https：//string-db.org）是一个基因、蛋白质相互作用关系的检索网。将乳积方和TNBC交集基因导入到检索框中，选择“homo sapines”进行分析。设定P＜0.05作为筛选条件，设置“隐藏游离点”、交互分数最低值为0.9，得到蛋白互作网络(protein protein interaction network，PPI network）分析结果。下载该TSV文件，对PPI网络中交集靶点度值进行统计，遴选出该网络的核心基因。

1.5 基因本体论(GO）分析和KEGG通路富集分析

Bioconductor(https：//www.bioconductor.org）是一个分析分子生物学实验产生的基因组数据的软件。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia ofGenesandGenomes， KEGG， https：//www.genome.jp/kegg/）是一个综合数据库，整合了基因组信息、化学信息和生化系统功能信息，其通路数据子数据库(PATHWAY）记录的是细胞分子相互作用网络以及具体生物所特有的变化形式。

从Bioconductor下载R语言的相应程序包[8，9]，使用R软件进行GO分析和KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 乳积方中活性成分及靶点的获取和筛选

通过TCMSP数据库检索，筛选出活性成分柴胡17个，白芍13个，党参21个，山慈菇3个，瓜蒌11个，浙贝母7个，海藻4个，预知子6个，王不留行4个，共计86个，排除重复成分后，整理如表1。

表1 乳积方中有效成分信息Table 1 Information of effective ingredients in Rujifang

（续表1）

根据活性成分结果，从TCMSP下载相应活性对应的靶点数据，共检索到药物靶点柴胡349个，白芍112个，党参214个，山慈菇29个，瓜蒌35个，浙贝母70个，海藻174个，预知子44个，王不留行193个。将上述靶点在Uniprot数据库进行比对，共取得靶点196个。

2.2 乳积方治疗TNBC的潜在靶点预测

使用GeneCards及OMIM进行TNBC相关基因筛选，共获得基因靶点3 751个，排除重复基因靶点，共收集到3 724个；使用R软件(3.6.1）VennDiagram包绘制药物活性成分靶点与TNBC疾病靶点的韦恩图，结果如图1，共有156个基因重叠。

图1 乳积方药物靶点与TNBC疾病靶点交集韦恩图（蓝色圆框为疾病靶点，红色圆框为药物靶点）Figure 1 Venn diagram of Rujifang drug targets and TNBC disease targets（The blue circle means the Disease target and the red circle means the Drug target）

2.3 疾病-方剂-药物有效成分-作用靶点的网络构建及分析

使用Cytoscape软件构建疾病-方剂-药物有效成分-作用靶点网络。将乳积方86个分子有效成分和156个关键基因导入Cytoscape，如图2所示。在乳积方-作用靶点的网络中，有效成分quercetin(槲皮素）度值最高，达708，如表2。基因NCOA2表达度值最高，达39，如表3。

2.4 蛋白互作网络(PPI网络）构建

图2 TNBC-乳积方-药物有效成分-作用靶点网络图（紫色方框为作用靶点，淡红色菱形为有效成分）Figure 2 Network of TNBC-Rujifang-effective ingredients-action targets （purple box means action targets，light red diamond means effective ingredients）

表2 Cytoscape网络中疾病关键靶基因度值前5位的乳积方有效成分Table 2 The effective ingredients of Rujifang in the top 5 of the target gene degree in Cytoscape network

将上述156个重叠基因导入STRING数据库获取蛋白质，得到交互文件，得到图3。下载TSV文件，统计度值前20位基因靶点，绘制柱状图，如图4，纵坐标为基因名，横坐标表示其度值，最大的JUN度值为34，其次为MAPK1、AKT1、RELA、IL6、 MAPK8、 APP、 ESR1、 MAPK14、 CXCL8。上述蛋白在PPI网络中具有重要地位，是乳积方治疗TNBC的关键基因。度值越大，代表其为核心基因的可能性最大。

2.5 关键靶点基因生物功能及通路分析

GO分析提示，乳积方的80个关键靶点基因主要的生物学功能有protein heterodimerization activity(蛋白异源二聚体作用），proximal promoter sequence-specific DNA binding(近端启动子序列特异性DNA结合），RNA polymeraseⅡproximal promoter sequence-specific DNA binding(RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA结合）和chromatin binding(染色质绑定）。说明乳积方治疗TNBC可以通过上述生物学功能参与多种生物调控而发挥作用。

表3 Cytoscape网络中乳积方有效成分度值前8位的TNBC基因Table 3 TNBC gene in the top 8 of effective ingredients of Rujifang in Cytoscape network

图3 乳积方与TNBC重叠靶点基因的PPI网络Figure 3 PPI network of overlapping target genes of Rujifang and TNBC

图4 PPI网络中靶点基因度值前20位Figure 4 Top 20 in PPI network of target genes degree

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集结果显示，乳积方治疗TNBC的关键基因靶点主要富集的通路有：PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、Apoptosis信号通路、细胞凋亡信号通路。并且与乙型肝炎、人类巨细胞病毒感染、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染，癌症的蛋白聚糖和动脉粥样硬化的MicroRNAs上调、下调有相关性，如图6、表4。

3 讨论

本研究结果显示乳积方中槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇和木犀草素度值大，说明上述成分在乳积方治疗TNBC中发挥了重要作用，其中槲皮素、山柰酚均为黄酮类化合物。槲皮素在柴胡中的量高达4.708 1 mg/g。山奈酚为白芍重要的有效成分，临床中柴胡、白芍经常作为药对使用以疏肝解郁。在一项对黄酮类化合物的药理研究中发现，其具有抗抑郁、抗肿瘤等药理活性[10，11]。这和乳腺癌病因病机中的“情志内伤”、“冲任失调”相呼应[12]。近年来研究发现槲皮素能诱导包括雌激素受体阳性乳腺癌细胞在内的9种肿瘤细胞系的细胞凋亡，使小鼠的肿瘤体积显著减少[13]。低剂量的山奈酚能通过阻断RhoA和Rac1信号通路，抑制TNBC细胞的转移和侵袭[14]。β-谷甾醇是山慈菇的主要有效成分，其对乳腺癌细胞具有较强的抗增殖活性[15]。木犀草素能降低乳腺癌细胞株的活力，加速细胞凋亡，提高miR-203的表达，而miR-203的表达与木犀草素的抗肿瘤作用呈正相关[16]。

图5 关键靶点生物学功能富集图Figure 5 Enrichment diagram of biological functions of key targets

表4 KEGG富集结果计数前5位Table 4 Top 5 of KEGG enrichment result

蛋白互助网络显示JUN、MAPK1、AKT1、RELA、IL6、MAPK8等靶点基因度值大，说明其在乳积方治疗TNBC机制中有重要作用。JUN属转录因子AP-1的亚家族，参与基因调节，促进细胞增殖[17]。在体外实验中，JUN表达可以促进新生小鼠的肝脏体积增长[18]。本研究GO分析提示，JUN可能通过蛋白异源二聚体和近端启动子序列特异性DNA结合发挥作用；AKT1属于AKT家族，同时AKT也是属于PI3K/Akt信号通路的节点分子，在乳腺肿瘤中以异常活化形式存在，促进肿瘤细胞的生长及增殖。一些针对AKT的小分子抑制剂，如Afuresertib、AZD5363、MK2206已作为抗癌药进入到临床试验阶段[19]。活化的AKT可以调节一系列与细胞增殖相关的蛋白，如P65(即RELA），从而参与肿瘤的侵袭转移[20]。RELA属于NF-κB家族，其激活与恶性肿瘤的发展呈正相关。IL6在晚期癌症中通常属于高表达，通过上调PIM1促进乳腺癌细胞的侵袭[21，22]。MAP激酶是多种生化信号的整合点，参与多种细胞过程如增殖、分化、转录调控和发育等[23]。上述研究报道与本研究结果相符。

图6 KEGG富集通路气泡图Figure 6 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway

PI3K/Akt信号通路为本研究发掘出的乳积方治疗TNBC最重要通路。有效成分β-谷甾醇可通过调节PI3K通路参与抗癌，核心靶点AKT1属于PI3K/Akt信号通路的节点分子，KEGG富集结果也提示PI3K-Akt信号通路出现频次最高。由此可见PI3K通路是乳积方治疗TNBC的一条重要通路。其可由不同细胞刺激物或毒素激活，参与肿瘤的增殖、分化、凋亡等过程，也能通过VEGF等相互作用，促进肿瘤血管新生；与下游CCND1相互作用，干扰细胞周期；与其下游的MAPK相作用，可导致细胞增殖[24，25]。PI3K/Akt通路在中医药治疗乳腺癌领域的研究尚少，主要集中在HER-2阳性乳腺癌，均为单药或者复方对该通路的下调作用研究[26-28]。

综上，本研究应用网络药理学方法，对乳积方有效成分、相关靶点、疾病蛋白和作用通路等进行梳理，发现乳积方治疗TNBC机制为多成分、多靶点、多通路的协同作用。由于数据库的完整性、数据筛选的规范性不统一，所以本研究结果仅作为参考，为下一步基础实验提供一个可能的方向。