高效液相色谱法测定保健食品中褪黑素含量不确定度的评估

李珍妮 曾文祥

摘 要：本文根据GB/T 5009.170-2003《保健食品中褪黑素含量的测定》，即通过高效液相色谱法多次测量保健品中褪黑素的含量，建立数学模型。并根据实验过程分析其中各种不确定度的来源，包括重复测定样品产生的相对不确定度、校准曲线引起的相对不确定度、试样质量的相對不确定度、试样最终定容体积的相对不确定度。最后综合各种不确定度因素，评估测定褪黑素的不确定度的水平。

关键词：褪黑素;高效液相色谱法;不确定度

Abstract：This article passed GB/T 5009.170-2003 “Determination of Melatonin Content in Health Foods”， that is， multiple measurements of melatonin content in health products by high performance liquid chromatography to establish a mathematical model. According to the experimental process， the sources of various uncertainties were analyzed， including the relative uncertainty caused by repeated determination of samples， the relative uncertainty caused by calibration curve， the relative uncertainty of sample mass， and the relative uncertainty of final volume of sample. Finally， the uncertainty level of melatonin was evaluated by integrating various uncertainty factors.

Key words：Melatonin; HPLC; Uncertainty

中图分类号：R155.5

褪黑素具有小剂量作用强、毒性低、无成瘾性等优点，被广泛接受和使用[1]。实验室有必要开展褪黑素含量检测以判定产品是否符合要求。对于第三方检测实验室，不确定度测量是质量控制的一部分，实验室应识别测量不确定度的贡献[2]。对检测和校准结果测量不确定度来源的识别应从分析测量过程入手，即对测量方法、测量系统和测量程序作详细研究[3]。

1 实验目的

评估高效液相色谱法测定保健食品中褪黑素含量的不确定度。

2 测定方法

2.1 主要仪器和试剂

高效液相色谱仪（配紫外检测器），电子天平，褪黑素标准物质，一级水。

2.2 方法依据

国家标准《保健食品中褪黑素含量的测定》

（GB/T 5009.170-2003）。

2.3 试样溶液制备

精确称量一粒片剂或胶囊于100 mL容量瓶中，以70%乙醇溶解后，超声波提取10 min。将提取液离心至澄清，取上清液1 mL于10 mL容量瓶中，以流动相定容至刻度线，经0.45 μm滤膜过滤后上机测试。

2.4 标准溶液的制备

称取31.8 mg褪黑素标准品（纯度99.5%）于100 mL

容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，得到浓度为316 μg·mL-1的褪黑素标准母液。然后稀释至7.91、15.8、31.6、63.2 μg·mL-1和158 μg·mL-1的标准系列溶液。

2.5 色谱条件

流动相：甲醇+水+三氟乙酸=45+55+0.05;流速1.0 mL·min-1;柱温为室温;进样量10 μL;色谱柱Symmetry C18，150 mm×3.9 mm，5 μm;检测波长222 nm。

3 数学模型

褪黑素含量的计算公式为：

（1）

式（1）中，X-试样中褪黑素含量，单位为mg·kg-1;

c-由校准曲线得到的测试液中褪黑素酸含量，单位为μg·mL-1;V-样品提取液体积，单位为mL;m-所取试样质量，单位为g;f-样品提取液的稀释倍数。

4 不确定度的来源分析

高效液相色谱法测定保健食品中褪黑素含量的过程中，不确定度来源主要有：①重复测定样品产生的相对不确定度urel（r）。②校准曲线引起的相对不确定度urel（cal）。③试样质量的相对不确定度urel（m）。④试样最终定容体积的相对不确定度urel（V）。

5 标准不确定度的评定

5.1 重复测定样品产生的相对不确定度urel（r）

在重复性条件下，对褪黑素原料样品进行7次测定，结果分别为1.015×106、0.946×106、0.976×106、

1.021×106、0.990×106、0.993×106 mg·kg-1和

0.974×106 mg·kg-1，则褪黑素含量的算术平均值x=0.99×106 mg·kg-1。

单次测量不确定度：

（2）

测量平均值的不确定度：

（3）

测量平均值相对不确定度：

（4）

5.2 校准曲线引起的不确定度urel（cal）

5.2.1 标准溶液配制引起的相对不确定度urel（c）

褪黑素标准溶液的配制可能产生不确定度，其来源包括：①标准物质纯度引起的不确定度。②标准物质称量引起的不确定度。③标准物质的溶解、定容及稀释过程产生的不确定度。

（1）标准物质纯度引起的不确定度。本实验采用Dr.Ehrenstorfer公司的褪黑素标准物质，其证书给出的信息是纯度99.5%，不确定度±0.5%，此不确定度可考虑为矩形分布，则其标准不确定度为：

（5）

相对标准不确定度

（6）

（2）标准物质称量引起的不确定度。标准物质的称量采用Sartorius BT224S电子天平，其检定证书给出的示值误差的扩展不确定度U为0.3 mg，包含因子k=2，则其标准不确定度为0.15 mg，由于实际称量两次（毛重-皮重），因此称量0.031 6 g褪黑素标准物质时，其相对标准不确定度

（7）

（3）标准物质的溶解、定容及稀释过程产生的不确定度。在标准物质溶解、定容及稀释过程中，不确定度主要来源于所使用量具体积的不确定度，实验进行过程中实验环境温度与量具计量时温度不同产生的不确定度。

称量好的褪黑素标准物质溶解、定容于100 mL容量瓶，得到标准母液。实验中使用100 mL容量瓶定容，100 mL容量瓶的相对不确定度urel（V1）包含两部分：①容量瓶体积的不确定度。根据JJG 196-2006的规定，A类100 mL容量瓶的容量允差为±0.10 mL，按三角分布换算成标准偏差为。②容

量瓶中溶液的温度与计量时的温度不同引起的体积不确定度。因液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，此处可只需考虑液体。假设实验室温度在±5 ℃变化，温度变化按矩形分布，水的体积膨胀系数为2.1×10-4，则由温度变化引起的不确定度=，以上二项合成，得出100 mL容量瓶的相对不确定度：

（8）

标准母液由分度吸量管转移至10 mL容量瓶。考虑标准系列的中间点，1 000 μL移液器转移1 mL

标准母液的相对不确定度urel（V2）包含两部分：①1 000 μL

移液器体积的不确定度。根据移液器（XQJS12022）的校准证书，其扩展不确定度U=0.67 μL，包含因子k=2，则其标准不确定度为0.34 μL。②移液器中溶液的温度与校准时的温度不同引起的体积不确定度。因液体的体积膨胀明显大于移液器本身的体积膨胀，此处可只需考虑液体。假设实验室温度在±5 ℃变化，温度变化按矩形分布，水的体积膨胀系数为2.1×10-4，则由温度变化引起的不确定度=，以上二项合成，得出1 000 μL移液器的相对不确定度：

（9）

吸取的标准母液定容至10 mL。实验中使用10 mL

容量瓶定容，得到测试用溶液，10 mL容量瓶的相对不确定度urel（V3）包含两部分：①容量瓶体积的不确定度。根据JJG 196-2006的规定，A类10 mL容量瓶的容量允差為±0.02 mL，按三角分布换算成标准偏差为。②容量瓶中溶液的温度与较正时的温度不同引起的体积不确定度，因液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，此处可只需考虑液体。假设实验室温度在±5 ℃变化，温度变化按矩形分布，水的体积膨胀系数为2.1×10-4，则由温度变化引起的不确定度，以上二项合成，得出10 mL容量瓶的相对不确定度：

（10）

以上3项合成，得到标准物质的溶解、定容及稀释过程产生的不确定度：

（11）

将上述三项合成，得到标准溶液配制引起的相对标准不确定度

（12）

5.2.2 校准曲线拟合引起的相对不确定度urel（f）

褪黑素标准工作曲线的绘制：采用标准母液配制标

准系列浓度为7.91、15.8、31.6、63.2μg·mL-1、158 μg·mL-1

的褪黑素工作液，5种浓度的工作液分别上机测定3次，浓度与峰面积的对应的关系见表1。

标准工作曲线为y=60 215x+20 936，相关系数R2=0.999 9，样品测试次数p=3，总校准点N=15。

校准曲线拟合的标准不确定度为：

（13）

式（13）中：x0-测得的褪黑素含量的估计值，为31.4 mg·L-1;x-绘制校准曲线时已知浓度值的平均值，为55.3 mg·L-1，b-校准曲线的斜率;SR-峰面积的残余标准差。

经计算：

（14）

（x0-x）2=571.2（15）

（16）

代入公式后，得到校准曲线拟合引起的样品中褪黑素测试液含量的标准不确定度=0.54 mg·L-1。

因此，校准曲线拟合引起的相对不确定度：

urel（f）=0.54/31.4=1.72×10-2（17）

将5.2.1和5.2.2两项合成，得到校准曲线引起的相对标准不确定度：

（18）

5.3 试样质量的相对不确定度urel（m）

本实验称取样品质量用的是赛多利斯BSA224S天平（编号1148JSS041），根据天平的检定证书，其示值误差的扩展不确定度U=0.3 mg，包含因子k=2，因此天平的标准不确定度为0.15 mg，由于实际称量两次（毛重-皮重），因此称量0.031 0 g样品时，其相对标准不确定度：

（19）

5.4 试样最终定容体积的相对不确定度urel（V）

样品是褪黑素原料，其中褪黑素的含量几乎为100%，其溶解、稀释定容的过程与标准品相近，其最终定容体积的相对不确定度的计算过程也与标准品一致，其结果可套用标准溶液配制的不确定度结果：

urel（V）=urel（V0）=1.42×10-3（20）

6 合成标准不确定度

综合以上计算，保健品中的褪黑素测量不确定度来源及数值见表2。

（21）

7 扩展不确定度

取包含因子为k=2，置信水平为95%，相对扩展不确定度：

U（95）=K×urel=2×2.19×10-2=4.4×10-2（22）

8 结果报告

样品中褪黑素的含量的扩展不确定度为（0.99×106±4.4×104）mg·kg-1（包含因子K=2，置信水平为95%），或99%±4.4%。

参考文献：

[1]李慧艳.褪黑素用对了才助眠[J].大众健康，2020（6）：64-65.

[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL 01：2018 检测和校准实验室能力认可准则[S].2019.

[3]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL 05：2011 测量不确定度要求的实施指南[S].2011.