农药的微生物降解研究现状

陈冬梅,关俊杰,张桂柯,张百重

（1.河南科技学院资源与环境学院,河南新乡453003；2.新乡市人民公园,河南新乡453000）

目前,农药是农林业生产中非常重要的防治工具,主要用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草和其他有害生物以及有目的地调节植物生长的化学试剂、天然物质及其制剂的总称.根据农药作用对象的不同,可将农药分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、杀鼠剂和植物生长调节剂.随着科学技术的不断发展,农药也在不断地变化,如从无机物到有机物,从高毒到低毒,剂型和种类也从简单到复杂.不可否认,农药被广泛应用以来,给农业增收带来了可观的经济效益.同时,农药带来的环境污染问题也是人们不得不面对的威胁,农药残留问题正在严重地威胁着人类健康以及生态平衡,解决农药对环境的污染问题引起人们的广泛关注.因此,必须加快对农药降解的研究进度,尤其是生物降解等环境友好型农药降解方式的研究与开发.

目前,微生物降解底物范围广、代谢方式丰富多样,已成为生物降解的主体方法[1].简单来讲,把有机物质转化成为简单无机物的过程就是微生物降解.与物理、化学等降解方式相比,生物降解被公认是一种有效、安全、廉价、无二次污染的降解方法,其主要优点是该方法可以利用现有的微生物或者其他可以利用的生物将残留于土壤、海洋和地下水中的有害有毒物质降解成CO2、H2O 或者转化成无害物质.

1 微生物降解农药的种类

当前自然界中存在着极其丰富的微生物资源,多种微生物在生物降解方面起着重要的作用.细菌、真菌、放线菌以及藻类等都被分离出用于可降解农药的微生物,例如细菌中的镰刀菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、硫杆菌属、假单孢菌属、节细菌属等,放线菌属的放线菌属、诺卡氏菌属、链霉菌属等[2-3].

2 微生物降解农药的途径

目前微生物降解农药常见的两种途径是微生物直接靶标作用于农药和微生物间接靶标作用于农药.

2.1 微生物直接靶标作用于农药

微生物降解农药通常是指微生物直接靶标作用于农药,这类方式一般是利用酶促反应对农药发挥作用,是化学物质通过一定的途径先进入细菌体内,再利用酶促反应,生理生化反应等过程,最后将农药降解为分子量较小的无毒或者低毒化合物.例如,新烟碱类农药可以通过羟基化反应、硝基还原等途径被降解为二氧化碳等小分子,也可以利用微生物降解新烟碱类农药的酶,产生强氧化能力的自由基,针对农药的功能基团,最终实现农药的分子降解[4].目前常见的微生物降解酶类主要有水解酶类和氧化还原酶类两大类,水解酶类主要有磷酸酶、酯酶、裂解酶、对硫磷水解酶、裂解酶等,氧化还原酶类主要指多酚氧化酶和过氧化酶等.

2.2 微生物间接靶标作用于农药

微生物间接靶标作用于农药是指微生物进入细菌体内发生的活动改变了其体内的化学和物理环境,从而对农药发挥作用的过程,也被归结为非酶促反应.间接作用主要包括：生物浓缩、累积、矿化、共代谢作用、种间协同代谢作用等[5].目前矿化作用是间接作用里面最理想的一种方式,矿化作用可以将农药完全降解为无毒化合物,归其原因是许多化学农药是天然化合物类似物,该类似物是可以作为微生物的营养源被微生物利用并分解为无机物、CO2、H2O 等物质.但是,如果有一些不能被微生物降解的化合物存在时,则需要利用一种可供碳源以及能源的辅助基质存在共同发挥作用才能将这类化合物降解,这就是共代谢作用[1,6].

3 影响微生物降解农药的因素

外因和内因是影响微生物降解农药的两种主要因素.环境物理化学和生物学条件是外因,农药和微生物的自身因素是内因.

3.1 环境因素

影响微生物降解农药的环境因素非常多,如温湿度、酸碱度、碳氮含量、粘度、盐度、通气情况和基质吸附作用等,这些因素均影响微生物降解农药的能力.酶类降解过程对温湿度也有要求,大多数微生物都有最适宜的生长温湿度.因为温湿度可以影响酶的活性和微生物代谢能力,也可以改变农药的物理状态,从而影响微生物降解农药的速率.如,江紫薇等[7]指出肠杆菌属（Enterobacter sp.）菌株SE08 在pH 值为6.0,温度为30 ℃时,24 h 内对500 mg/L 二甲四氯的降解率达到最大.Dong 等[8]指出在芦苇和枯草芽孢杆菌共同存在的情况下, 协调生物修复原油污染的土壤比单独枯草芽孢杆菌存在时的降解率要高.Horemans 课题组[9]指出能提供碳源的有机物的浓度和性质会影响三种混合菌（Variovorax sp.,Comamonas testosterone,Hyphomicrobium sulfonivorans）对利谷隆的降解活性,当仅加入利谷隆时（质量浓度10 mg/L）,降解活性达到85%；但是同时向培养基里加入柠檬酸盐和较高浓度的可溶性有机物,利谷隆降解活性明显降低.

3.2 农药自身因素

农药自身因素是影响微生物降解农药的重要限制因素之一.不同的农药使用量、农药的化学结构、空间结构以及分子排列顺序等都会影响微生物降解农药的速率.通常来讲,农药的使用量以及分子量越小,结构越简单越容易被降解；相反,农药分子结构中的支链越多越不容易被降解.

同类化合物中影响微生物降解农药的因素主要有化合物取代基的数量、位置和种类,以及取代基团的大小等.取代基数量越多、取代基团分子越大就越难被微生物降解.如,2,4-D 与2,4,5-T 在土壤中或者水中的降解速度就有很大的差别,因为2,4,5-T 在第5 位碳原子处增加了1 个氯原子,因此导致降解时间由原来的4 周增加到了20 周,成为十分难降解的化合物.另外,苯环上的取代基为羧基或烃基的化合物易降解；相反,卤族元素为苯环取代基（比如氯苯、二氯苯）时,则此化合物很难被降解[10].李玉梅团队[11]曾利用富集驯化培养方式从哈尔滨农药污水厂处理池的活性污泥中筛选出2 种能彻底降解氧化乐果的菌株,这2 种菌株分别为气球菌属和假单胞菌属.研究结果显示：质量浓度为100 mg/L 的氧化乐果在2 种菌株的作用下1 d 就可以被降解,当其质量浓度为400 mg/L 时,则需3 d 才可实现完全降解.当质量浓度上升为1 000 mg/L 时,则需要7 d 左右才可以实现全部降解.当氧化乐果的质量浓度上升到2 000 mg/L时,气球菌属和假单胞菌属对氧化乐果7 d 内的降解速率分别是72.42%和75.28%.

3.3 微生物自身因素

微生物的适应性、代谢活性以及种类等因素都可以直接影响微生物对农药降解和转化过程,同一种类的不同菌株或者不同微生物种类对同一种农药降解都不尽相同.段海明团队[12]为明确2 株蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）混合对毒死蜱的降解效果,考察了不同配比混合菌和不同环境因素对混合菌降解毒死蜱的影响.结果表明,两菌株的比例为1∶1（V∶V）时,对质量浓度为80 mg/L 毒死蜱的降解率最高,并且比单一菌株的降解率高.

4 微生物降解农药的主要类别

杀虫剂、杀菌剂和除草剂是目前农林业生产应用过程中使用率较高的农药,也是对农林业发挥作用比较大的农药.

4.1 杀虫剂的微生物降解

目前,部分可以降解杀虫剂的微生物资源[13-21]如表1 所示.

表1 杀虫剂的微生物降解资源Tab.1 Microbial resources for pesticides degradation

微生物降解有机磷和有机氯类杀虫剂的研究较多,多种微生物降解菌被发现.如：Paul 等[13]发现褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）能够利用硫丹作为碳源和能源物质, 在蔗糖存在的条件下,A.chroococcum JL104 和A.chroococcum JL15 对低浓度的硫丹降解并不明显；在无蔗糖存在时它们各自对硫丹的最大降解质量浓度为40 μg/mL 和60 μg/mL；在硫丹质量浓度为10 μg/mL 时,降解率为93.3%～98.5%；质量浓度为100 μg/mL 时降解率为63.8%～78.2%,因此,褐球固氮菌是很好的硫丹降解菌.Ahire等[14]曾对印度有农药使用记录的田地和造纸处理厂的污水进行富集培养分离检测,第一次分离检测培养基中含葡萄糖和磷酸三丁酯,7 d 后,仅分离出15 种磷酸三丁酯降解菌株,这些菌株经过生物化学和形态学特征以及16srRNA 基因序列分析,结果显示分别是产碱杆菌属（Alcaligenes）、普罗维登斯菌属（Providencia）、代尔夫特菌属（Delftia）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）、芽孢杆菌属（Bacillus）.通过GC-MS分析Providencia sp.BGW4 和Delftia sp.BGW1 在4 d 内对磷酸三丁酯的降解率分别为61.0±2.8%和57.0±2.0%.Xie 等[15]实验研究过程是从农药厂的污泥和DDT 污染的土壤中分离出一种DDT 降解菌,这种菌是通过定期不间断的向培养液中加入含有不同浓度的DDT 的无机盐分离出来的,影响其对DDT降解率的因素有pH 值、温度,DDT 浓度和葡萄糖的浓度,经过形态学、生理生化特征和16srDNA 分析该菌属于产碱杆菌属；10 d 后,该菌株KK 对DDT 的降解率为66.5%,当在培养基中加入0.5%葡萄糖溶液、质量浓度为10 mg/L 的DDT 溶液、pH 值为6、培养温度为30 ℃时,DDT 降解率最大；当DDT 的质量分数达到0.02‰以上时,产碱杆菌属菌株KK 的生长就受到抑制.氨基甲酸酯类农药的微生物降解研究也取得了一定的成果,例如,武俊等[16]从活性污泥中筛选出1 株高效降解菌Sphingomonas sp.CDS-1,其降解质量浓度为100 mg/L 的克百威仅需14 h,降解质量浓度为200mg/L 的克百威只需72 h.另外,刘宪华等[17-18]利用实验途径将1 株能高效的降解氨基甲酸类农药的菌株——假单胞菌AEBL3,从长期受污染的土壤中分离出来,AEBL3 能在呋喃丹的诱导下能产生较高活性的呋喃丹水解酶, 从而实现对农药的高效降解.

对于烟碱类农药的生物降解研究也有报道.赵丽萍等[19]曾利用实验手段将巴氏微杆菌菌株11L140筛选出来,11L140 能够利用烟碱作为碳氮源,其酸碱度为7.0,温度为30 ℃,如果将这类菌株在烟碱浓度为1‰和2‰的培养基中培养54 h,其降解烟碱类农药的效率可达到98.76%和89.52%.另外,汤鸣强等[20]曾利用室内培养的方法, 结合平板画线以及富集驯化培养等方式从土壤中分离出一种细菌菌株BB-1,后来经实验证明,BB-1 能够有效降解吡虫啉.

文献记载的拟除虫菊酯类农药的微生物降解菌主要有粘质沙雷氏菌DeI-1 和DeI-2,这两种菌是Cycon′等[21]利用实验手段从土壤中分离出来,当溴氰菊酯的质量浓度为50 mg/L 时,10 d 后DeI-1 对溴氰菊酯的降解率达到88.3%,DeI-2 对溴氰菊酯的降解率达到82.8%,另外,通过向含有溴氰菊酯的不同类型土壤和液体基质中加入两种黏质沙雷氏菌DeI-1 和DeI-2,能够有效地修复溴氰菊酯污染的土壤.

4.2 杀菌剂的微生物降解

杀菌剂分为传统多作用位点杀菌剂和现代选择性杀菌剂,农林业生产上使用的杀菌剂多为现代选择性杀菌剂,因其具有高效低毒低残留等优点而备受用户喜爱.但是,一些杀菌剂的不合理使用,导致了环境的严重污染,基于对环境的保护,研究杀菌剂的微生物降解具有十分重要的意义和价值,部分微生物降解杀菌剂方面的研究[22-28]如表2 所示.

表2 杀菌剂的微生物降解资源Tab.2 Microbial resources for fungicides degradation

多菌灵的微生物降解研究较多,蒲丹等[22]从成都彭州蔬菜基地土壤中分离得到1 株能以多菌灵作为唯一碳氮源生长的细菌GRPD-1,鉴定其为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）,该菌株在以多菌灵为唯一碳氮源的基础上,在培养基中培养6 d,对50 mL 多菌灵的降解率达60%；添加少量葡萄糖、蛋白质作为额外碳氮源时可促进菌株GRPD-1 对多菌灵的降解,第2 天的降解率能提高到90%以上.解林奇等[23]采用无机盐培养基富集方法筛选降解多菌灵菌系及菌株,并筛选到9 个菌系,纯培养条件下10 d 对初始质量浓度600 mg/L 的多菌灵降解率为23.14%～70.64%；从5 个降解菌系中筛选出5 株降解菌,编号为111-3、161-4、165-2、166-2、167-4,纯培养条件下15 d 对初始质量浓度600 mg/L 多菌灵降解率为33.90%～72.66%；菌株111-3、165-2、166-2、167-4 初步鉴定为红球菌属（Rhodococcus sp.）,菌株161-4 初步鉴定为寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）.在实验室条件下,分别接种筛选到的9 个菌系和5 株降解菌处理污染土壤,72 h 对初始质量浓度5 mg/kg 多菌灵的降解率均达到90%以上.李明石等[24]从长期施用多菌灵农药的土壤中,通过对温度进行条件优化,筛选获得1 株耐冷多菌灵高效降解菌株,此菌株与肠杆菌属（Enterobacter）亲缘关系最近,命名为Enterobacter sp.D5；该菌株能在唯一碳源的质量浓度为100 mg/L 多菌灵无机盐培养基中生长, 在15 ℃、pH 值7.0、200 r/min 的生长条件下避光振荡培养12 d,多菌灵的降解率达到100%；在最适培养条件下外加氮源可以提高多菌灵的降解率,Lin 等[25]从长期喷洒多菌灵的葡萄园的土壤中分离出1 株有效的多菌灵降解菌株XJ-D,经鉴定该菌株为红串球菌（Rhodococcus erythropolis）,它能够利用多菌灵作为单一的碳源或氮源,当多菌灵质量浓度为600 mg/L时,该菌株对多菌灵的降解率达到99.0%.Zhang 等[26]从湖南省祁阳县多菌灵处理过的红土中分离出1 株多菌灵降解细菌1-1,经过鉴定该菌为茄科劳尔氏菌（Ralstonia sp.）,在多菌灵质量浓度为20 mg/L 的培养基中外加酵母膏,24d 后降解率达到95.96%,未加酵母膏24 d 后降解率达到19.16%.Xiao 等[27]通过盆栽实验协同微生物修复镉和多菌灵污染的土壤,得到降解菌：芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、副球菌（Paracoccus sp）..黄杆菌（Flavobacterium）、假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）,在多菌灵质量分数达到0.020 5‰,镉为1.1mg/kg 低污染水平下,32 d 后多菌灵的降解率达到83.3%,而单独用降解菌的降解率仅为68.6%.南景天和多菌灵降解菌的协同修复作用能够改变土壤中微生物的活性和种群的结构,进而修复污染的土壤,植物和微生物协同修复环境污染将是未来的发展方向.

郑重[28]用土柱环液装置作连续富集培养,分离1 株总状共头霉（Sycephalastrum racemosum）,该菌具有转化杀菌剂甲霜灵的能力,当培养液中甲霜灵的质量浓度在10 μg/mL 以下时,总状共头霉对甲霜灵的分解能力最强.

4.3 除草剂的微生物降解

除草剂通常是指预防或杀死农林杂草的化学农药.十九世纪末利用硫酸铜防治麦田的十字花科杂草是最早应用除草剂的案例,十九世纪四五十年代选择性除草剂2,4-D、二甲四氯的相继发现,开辟了除草剂的新纪元,随着植物生理生化、生物技术和化工合成等领域的发展,除草剂也随之快速发展.近年来除草剂类型大量出现,如磺酰脲类、咪唑啉酮类、磺酰胺类除草剂等.除草剂可分为灭生性除草剂和选择性除草剂,常用的除草剂主要有苯氧乙酸类、二硝基苯胺类、三氮苯类、酰胺类、磺酰脲类、氨基甲酸酯类和有机磷类[29].除草剂的应用给人们的生产、生活带来了便利,但同时由于除草剂的大量使用或不合理使用,对环境造成了严重的污染.目前部分微生物降解除草剂的研究方法总结[30-40]如表3 所示.

表3 除草剂的微生物降解资源Tab.3 Microbial resources for herbicides degradation

Onneby[41]提出了一种新的观点,通过利用农药和能够降解农药的微生物去减少农药的扩散污染,在农用土壤和沙土中同时喷洒除草剂和除草剂降解菌鞘氨醇单胞菌和钩虫贪铜菌,结果表明1 d 内土壤中2,4-D 的降解率在80%-99%,3 d 后大于99%,能够有效地降解除草剂.

三氮苯类除草剂的作用机制主要是指抑制光合作用中电子的传递,三氮苯类除草剂种类繁多,常用的主要有莠去净、扑草净、西草净等除草剂.周宁[31]从黑龙江省长期施用莠去津的玉米田土壤中筛选到以莠去津为唯一碳、氮源的菌株Z9 和以莠去津为唯一氮源的菌株Z42,培养14 d 后,莠去津的降解率可达77.7%和65.6%,通过鉴定,Z9 为微杆菌属（Microbacterium sp.）细菌,Z42 为节杆菌属（Arthrobacter sp.）细菌；比较单一菌株和混合菌株降解莠去津的效果后可知,混合菌降解莠去津的效果优于单一菌株的降解莠去津的效果.朱静等[32]用富集培养法从城市污水处理厂的污泥中分离得到1 株能够降解除草剂阿特拉津的降解菌株,并命名为L-1,接种于质量浓度为500 mg/L 的阿特拉津无机盐培养基,96 h 后阿特拉津的降解率达到94.8%；初步鉴定并对其降解特性进行研究,结果表明,该菌株被鉴定为节杆菌（Arthrobacter sp.）,菌株L-1 对阿特拉津最佳降解条件为30 ℃,初始pH 值范围为7～8.周际海等[33]从安徽农药厂废水处理系统的活性污泥中筛选扑草净（Prometryne）降解菌,通过富集驯化和选择性培养筛选纯化细菌,分离到2 株细菌,分别命名为P-1、P-2,经鉴定P-1 为苍白杆菌属（Ochrobactrum）,P-2 为芽胞杆菌属（Bacillus）；通过12 d 液体降解实验,菌株P-1、P-2 对40 mg/L 扑草净降解率分别达到46.5%和65.4%,该研究为扑草净的生物降解与污染土壤的生物修复提供了依据.

国内外对微生物降解磺胺类和磺酰脲类除草剂的研究也取得一定的进展.陈颖曦等[34]从湖南瑞泽农药厂污水池中筛选到1 株吡嘧磺隆降解菌DFI2,被鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）,该菌在100 mL 三角瓶、接种量2.0%（OD600=0.80）、pH 值为7.0 条件下对吡嘧磺隆降解率可达74.78%.邹月利[35]在氯嘧磺隆的初始质量浓度为10.0 mg/L、接种量为5.0 mL 菌悬母液、反应液温度为30 ℃、恒温振荡的条件下培养7 d,真菌黑曲霉（TR-H）可以降解96.4%以上的氯嘧磺隆.Pukkila 等[36]研究发现在北极地区和芬兰南部表土层和矿物层的地下水中,微生物降解敌草腈的现象是普遍存在的,但是能够获得降解敌草腈和2,6- 二氯苯甲酰胺降解菌的量很少,在降解微生物（3.6～210 MPNgdw-1）含量低的情况下,敌草腈的降解率为45.5±18.3%,2,6- 二氯苯甲酰胺的降解率为37.6±14%.

最近微生物降解酰胺类和有机磷类除草剂的研究有：彭亚军等[37-38]发现1 株丁草胺高效降解细菌克雷白氏杆菌属（klebsiella sp.）,在30 ℃、pH 值7.0 条件下7 d 可降解89.6%的丁草胺,是1 株有效的丁草胺降解菌.假单胞菌属（Pseudomonas sp.）菌株Y-1 降解丁草胺的最优条件为：丁草胺初始质量浓度20 mg/L、接种量5%、pH 值7、培养温度30 ℃,在最优环境条件下培养7 d,Y-1 能降解培养液中76%的丁草胺,显示了良好的降解能力.Wu 等[39]研究发现米曲霉（Aspergillus oyzae sp.）A-F02 在30 ℃、pH 值为7.5、转速为150 r/min、草甘膦质量浓度为1500 mg/L 的条件下,7 d 后的降解率为86.82%.Ternan 等[40]研究发现能降解有机磷酸酯类化合物的降解菌有：桔青霉（Penicillium citrinum）、青霉菌（P.notatum）、哈茨木霉菌（Trichoderma harzanium）、黑曲霉（Aspergillus niger）、帚霉菌（Scopulariopsis sp.）树脂枝孢霉菌（Cladosporium resinae）和嗜麦芽黄单胞菌（Xanthomonas maltophilia）能够降解草甘膦.McAuliffe 等[41]研究发现放射性土壤农杆菌（Agrobacterium radiobacter）和无色杆菌（Achromobaeter VD）两种细菌能够降解草甘膦,并能生长在含有草甘膦的废水中,同时能够在含有成分明确的无机盐和碳源物质的草甘膦富集和分离的培养基中生长,并将草甘膦降解为无机的氨甲基膦酸,放射性土壤农杆菌在振荡培养4 d 后对草甘膦的降解率达到50%,7 d 后质量浓度为1 099 mg/L 的草甘膦被完全降解为无机的氨甲基膦酸.

5 微生物降解农药过程中存在的问题及展望

目前,微生物降解农药的安全性比较高,人们对农药微生物降解的研究越来越多,很多能够降解农药的微生物菌株（细菌和真菌）,已经相继被分离鉴定出来.但是,由于降解农药的微生物的菌株分离鉴定过程复杂,过程困难,这对微生物降解农药的过程增加了难度.目前,农药微生物降解的技术尚不成熟,大部分研究成果还局限于实验室研究阶段.建议科研工作者今后从以下几个方面深入开展农药微生物降解的研究.

（1）培养混合菌、开发高效农药降解菌、继续研究白腐真菌降解农药；

（2）如何更好的把降解菌固定化等研究作为今后农药微生物降解的方向[2]；

（3）如今基因工程和分子生物学研究较多,农药微生物降解的研究也在朝着这个方向发展[42],能否可以利用构建基因工程菌等方式来降解比较难以降解的农药.如Li[43]等人利用大肠杆菌构建出一种基因工程菌,该菌能够很好的降解有机磷农药,并且有很好的环境相容性.因此,结合基因工程和分子生物学,可以将基因工程菌的研究作为今后农药微生物降解的重点研究方向.