P.g.LPS诱导的miR-19a调控hPDLFs中TLR2及BSP的表达

魏蓉 张源 李新月

1. 300071 天津, 南开大学医学院; 2. 天津市口腔医院牙周病科

miRNA参与调控包括牙周炎在内的多种免疫炎症反应及肿瘤发生发展[1-2]。在人牙周膜成纤维细胞(human periondontal ligament fibroblasts，hPDLFs)中，LPS通过Toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)特异性下调骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)的表达，可能与牙槽骨代谢有关[3]；miR-19a在牙周炎性组织中异常表达[4]，并且与TLR2间具有负性靶向作用位点[5]，但其与牙周炎相关研究少有报道。本实验研究hPDLFs中miR-19a对TLR2及BSP的表达影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

Trizol试剂(Invitrogen，美国);M-MLV 逆转录酶(Takara，日本);CG-02/05实时荧光定量PCR仪[HealForce,力新仪器(上海)有限公司];P.g.LPS(InvivoGene，美国);HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物)。

1.2 方法

1.2.1 hPDLFs的培养及分组处理 取因正畸拔除(已经过天津市口腔医院医学伦理审查)的双尖牙根中1/3牙周膜组织培养细胞并传代。分别测定空白对照组及LPS诱导组的miR-19amRNA表达；分为空白对照组、阴性对照组(LPS组)、miR-19a过表达对照组、miR-19a过表达组、miR-19a抑制对照组、miR-19a抑制组分别空白或LPS处理。

1.2.2 Real-time PCR 用Trizol试剂提取总RNA，miR-19a以U6为内参,TLR2及BSP以β-actin为内参，按逆转录试剂盒要求逆转录制备cDNA，实时荧光定量法测定其mRNA表达，相对定量法计算其CT值。

1.2.3 Western blot 提取总蛋白，取40 μg行电泳、转移印迹、封闭，经一抗、二抗结合后曝光显影、定影处理。用LabWorksTM系统摄像，分析各组条带的亮度值，与对应GAPDH(内参照)条带相比，得到校正值。

1.3 统计学分析

2 结 果

hPDLFs经P.g.LPS诱导后，miR-19a mRNA表达水平升高约2.6 倍(图 1)。过表达miR-19a在mRNA(P=0.001)及蛋白(P=0.000)水平均能明显降低LPS对TLR2的激活作用(图 2)；过表达miR-19a能拮抗LPS对BSP的下调作用，这种下调作用在mRNA(P=0.010)及蛋白水平(P=0.005)是一致的(图 3)。

图 1 正常及LPS诱导下hPDLFs中miR-19a的表达

图 2 miR-19a对hPDLFs在LPS诱导下TLR2表达水平的影响

图 3 miR-19a对hPDLFs在LPS诱导下LPS表达水平的影响

3 讨 论

在P.g.LPS诱导的牙周炎细胞模型中发现hPDLFs中miR-19a表达上调约2.6 倍，与前期研究报道牙周炎性组织中其表达水平升高约2～5 倍的结论一致[3]。但其与TLR2的同时上调似乎在hPDLFs中并不符合二者的负性靶向作用关系，这种现象的原因可能是：mRNA的表达受到多种miRNA的调控，LPS诱导hPDLFs后TLR2升高，但细胞(和机体)内受多种机制调控影响，TLR2受到多种miRNA的调控，miR-19a可能只作为其中之一，且miRNA对靶标因子多起微调作用[6]，因此LPS诱导后二者的变化并未表现为明显的负性相关；此外，miRNA的调控作用具有时间特异性[7]，miR-19a在hPDLFs中的表达可能也呈现时间相关性，需要后续实验进行验证；进一步研究发现，hPDLFs中过表达miR-19a可以抑制LPS对TLR2的激活作用，且抑制miR-19a也可部分上调TLR2的mRNA(P>0.05)和蛋白水平(P=0.020)，证实了miR-19a在hPDLFs中对TLR2的调节也为负性作用关系。

BSP是一种多功能细胞外基质蛋白，在牙骨质形成、牙周组织再生中有重要作用。过表达miR-19a能上调BSP的表达，部分抵消LPS对BSP的抑制作用，可能与牙槽骨代谢相关。尽管抑制miR-19a对上调TLR2和抑制BSP的作用并无统计学意义，但其对二者的调控趋势符合miR-19a与TLR2间负性作用关系的假设；此外，过表达miR-19a对于抑制TLR2、上调BSP更具有生理性意义：在hPDLFs中，LPS刺激后miR-19a升高抑制TLR2的表达，调控机体免疫应答；同时上调BSP意味着在牙周炎发生发展中，miR-19a可能起到了抑制牙槽骨吸收的作用。但这种调控作用是否是通过TLR2介导有待继续研究。

综上，miR-19a能够负性调控TLR2，正向调控BSP的表达水平，部分抵消LPS的病理作用，在牙周炎发生发展中可能具有积极作用。