分子诊断技术在结直肠癌个体化诊疗中的作用

帕尔哈提·阿布都热衣木，穆拉迪力·阿瓦克

（新疆医科大学第六附属医院普外科 新疆 乌鲁木齐 830002）

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，其中直肠及直肠与乙状结肠交界处结直肠癌发病率约为60%，一般从40 岁开始发病率上升，到60 ～75 岁之间达到高峰，男性发病率为女性的两倍[1]，被公认为世界上最常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤中死亡原因中排第4 位。新研发出的分子诊断技术较长时间以来已经在结直肠癌的早期诊断、分子生物学上的分型、恶性肿瘤组织的生物学行为、病情转归的预测、药物的选择和药物治疗效果的监测等方面广泛应用并得到了较成熟的经验，但这种分子诊断技术对于结直肠癌个体化诊治方面的应用相关的研究仍要求深入探索。

1.结直肠癌的分子分型

目前相关研究显示，结直肠癌患者中基因型为染色体不稳定型（chromosomal instability，CIN）占70%，这是患者染体内色体的异常聚集和患者体内跟肿瘤有关的抑癌基因位点杂合性缺失的原因，并存在原癌基因的突变，这种类型的结直肠癌好发于远端结肠；约15%结直肠癌患者因DNA 错配修复基因（DNA mismatch repair genes，DNA MMR）缺失而表现为微卫星不稳定型（microsatellite instability，MSI），常发生部位为近端结肠；另外15%～20%的患者基因型通常与锯齿状癌前病变和MSI 通路相互有关系，常表现为CpG 岛表型甲基化（CpG island methylation phenotype，CIMP）型，发生部位为近端结肠。1997年在美国第一次推荐根据MSI 表达状态来将结直肠癌分为MSI-L型、MSI-H 型和MSS 型；此外，根据CIMP 不同的状态可以把结直肠癌分为CIMP-H 型、CIMP-L 型和CIMP-0 型。与此同时，在以上分类基础上可根据MSI、CIMP 和CIN 状态，我们把结直肠癌分为MSI 型、CIMP-only 型、CIMP+CIN 型、CIN-only 型和三阴型。

目前已经发现了多种跟结直肠癌有关的基因，其中能够对结直肠癌患者的个体化治疗起指导作用的基因有KRAS（v-Ki-ras2鼠Kirsten 肉瘤病毒致癌基因同源物）、BRAF（鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1 基因）、PIK3CA（磷酸肌醇-3-激酶催化亚基α 基因）、HER2（人表皮生长因子受体2）[2]和APC（结肠腺瘤性息肉病基因）[3]。

2.分子标志物在结直肠癌中的应用

2.1 循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）

ctDNA 是指一种存在于血液、脑脊液和滑膜液等细胞外环境的脱氧核糖核酸。检测患者体内取得少量样本中的ctDNA 突变，有助于识别复发风险高的患者，这既为动态观察化疗反应提供指南，又为少数结直肠癌患者制定个体化治疗方案提供指南。最近出现的新技术不仅对ctDNA 中已知突变的监测有帮助，还可以通过动态监测结直肠癌治疗过程中发生的变化来发现结直肠癌治疗中出现的新耐药机制；研究发现罹患结肠肿瘤的人体中ctDNA 的含量显著高于未患有结直肠癌的健康人体中血液循环肿瘤基因，这提示可以把血清中ctDNA 含量检测出来，并把检测结果当做发现早期结直肠癌患者的筛选指标。

2.2 循环游离细胞DNA（Circulating cell-free DNA，cfDNA）

cfDNA 是循环血中游离于细胞外的部分降解而产生的机体内源性脱氧核糖核酸；在恶性肿瘤患者的体内，ctDNA 是来自cfDNA 一部分的分子标记物，而在外周血中坏死或程序性死亡（凋亡）的非肿瘤细胞也在外周血中释放cfDNA。研究结果显示，肿瘤患者体内外周血ctDNA 含量高，并且肿瘤患者体内ctDNA 跟肿瘤细胞或肿瘤组织的生物学特点相同，这表明肿瘤患者体内的大多数cfDNA 由肿瘤细胞释放而来[4]。Frattini 等[5]动态监测结肠肿瘤患者的cfDNA 的含量显示已经接受手术治疗的结肠肿瘤患者体内的cfDNA 含量大幅度下降，而病情恶化的患者体内的cfDNA 含量是非常高的，可用cfDNA 来进行动态观察人体内肿瘤的遗传信息的表达和变化、估计病情转归，评定对结肠肿瘤的生长抑制或打击效果。

2.3 循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTC）

CTC 是肿瘤患者的外周血中存在的具有完整细胞结构的肿瘤细胞。结直肠癌的诊断过程常涉及到与CTC 相关的一些标记物，目前最常并具有特征的标记物有EpCAM、CKl8、19、20 及CEA[6]；目前，检查出的CTC 在临床实践中的应用主要包括对可疑患者进行诊断、结直肠肿瘤患者病情控制情况的评估两个方面。

2.4 微小RNA（microRNA，miRNA）

是一类非编码单链RNA 分子，作为一种跟遗传相关的重要分子，经常参加基因表达的调控，从而成为一种跟致病密切相关的遗传物质。miRNA 能阻断遗传信息的翻译或加速目标mRNA 的降解，从而精细地调节生长发育、信号转导、免疫调节、细胞死亡、细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖和肿瘤的出现等生物学过程[7]。李雪等[8]从结直肠肿瘤组织中提取miRNA452-5P，发现这种非编码的单链RNA 分子基因表达水平明显降低，而miRNA215-5p 基因表达水平明显上升，且2-miRNAs panel 对结直肠癌有较高的诊断价值，能够当做结直肠癌诊断价值的潜在的分子标志物和治疗靶点。王胜等[9]发现 miR-1183 的基因表达水平在结直肠肿瘤组织中最高。结直肠癌患者血清中miR-200a 和miR-190 的表达水平均下降，可当作早期诊断结直肠癌和预测手术治疗后复发的标志物，两者联合检测时效果更佳。

3.结直肠癌相关信号通路和靶向药物的作用

3.1 表皮生长因子受体（EGFR）通路

EGFR 是跨膜受体，十种不同的配体可以选择性地结合每个受体，配体与单链EGFR 结合后，受体形成二聚体，通过酪氨酸激酶活性激活受体自磷酸化，从而在细胞内发出信号，而自磷酸化触发一系列细胞内途径，可能导致癌细胞增殖、阻断凋亡、活化、向周围侵犯和转移，并刺激新的肿瘤血管形成。结直肠癌患者携带的原癌基因KRAS的突变能直接激活下游的MAPK信号通道，从而引起抗EGFR 单克隆抗体无效，甚至会出现携带KRAS 基因突变的患者因使用抗EGFR 单克隆抗体（EGFRmAb）治疗而受伤害。

3.2 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路

PI3K/AKT 信号通路通过介导EGFR 进一步促进肿瘤细胞的生长，外显子9 和外显子20 均发生突变的结直肠癌患者约为15%，外显子20 突变的同时外显子9 表现为野生型的结直肠癌患者与抗EGFR 单克隆抗体耐药相关。结直肠癌患者体内磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α 基因（PIK3CA）的突变导致磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3）的激活，进一步增加环氧化酶2（COX2）的活性和促进前列腺素E2（PGE2）的合成而阻碍结直肠癌细胞的凋亡。

3.3 血管内皮生长因子（VEGF）

VEGF 是一种作用很强的血管生成刺激因子，即能加快肿瘤血管生成又能使血管通透性增强，与肿瘤生长及转移密切相关。贝伐单抗作用于VEGF 通路，能显著的抑制肿瘤血管生成，进一步阻止肿瘤细胞经血液转移到远处的组织器官上形成转移瘤，抑制肿瘤细胞向周围侵袭，因此，贝伐单抗目前临床上作为一线靶向药物。

4.展望

目前，随着治疗模式的逐渐成熟，能有效治疗多数结直肠癌患者，但对每一位结直肠癌患者，降低治疗成本而得到最优化的治疗效果、最大限度降低药物不良反应、对肿瘤转归良好的判断，需要对每一位结直肠癌患者个体进行具体分析。为达到延长患者寿命、提高生存质量的目的，检测分子标记物来分析化疗药物在肿瘤细胞中代谢机制是重要的一步，但是依靠目前的医学检测条件仍无法找到结直肠癌分子生物学分型的标准，现有分型方法仍不完整，存在许多缺陷，仅根据肿瘤细胞中少数的遗传物质的检测还不能对结直肠癌患者完整的实施个体化治疗方案，多因素综合分析会成为未来个体化治疗的发展方向。