银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤大鼠炎性因子、血管新生和认知功能的影响

张艳艳，柴丽娜

心肌缺血再灌注损伤是指心肌组织在长时间缺血后再恢复血液的灌流，但会出现更严重的心肌损伤和功能失常，主要现象为冠状动脉血流量减少和血管反应性改变等[1]。近年来，高血压、高脂血症等疾病的发病率逐年提高，导致冠状动脉粥样硬化性心脏病以及引发的急性心肌梗死发病率也随之增加，严重威胁人类的身心健康[2]。急性心肌梗死在心血管疾病中为高发病率和高死亡率的疾病之一，因此，心肌缺血再灌注损伤的关注度也逐年增加[3]。但心肌缺血再灌注损伤的病理机制极其繁杂，目前相关研究发现心功能异常、炎症反应和血管新生等是其病程发生发展的关键病理机制。

炎症反应是心肌缺血再灌注损伤的主要发病机制[4]。有关研究表明，急性心肌梗死会活化补体和产生自由基，引发梗死的心肌释放炎性因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)[5]。TNF-α继而刺激白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等其他促炎细胞因子。有研究表明促炎细胞因子IL-6和TNF-α是心肌功能障碍的关键损害因子。IL-6和TNF-α将进一步激发炎症细胞黏附、浸润到心肌，继而阻塞毛细血管、血管活性物质和释放细胞毒性成分[6]。有研究发现，缺血损伤后再灌注过程中炎症反应处于升高水平，而阻断炎症反应将有利于心肌缺血再灌注病人的恢复[7]。血管新生可促进相应缺血组织周围侧支循环的建立，改善心肌缺血和坏死等，恢复心肌血流量，从而改善心肌缺血再灌注病人的疗效和预后情况[8]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)为促血管生成因子，在血管新生的过程中起重要作用。有研究表明，在心肌缺血再灌注病人中，VEGF蛋白表达水平明显降低[9]。

目前，心肌缺血再灌注的主要治疗方式是溶栓和急诊经皮冠状动脉介入治疗，均是心肌治疗最实用和最广泛的措施，但是疗效均不尽如人意。银杏内酯B是一种从银杏叶中提取的活性物质，具有抗氧化、抗炎、促血管新生等生物学作用[10]。有研究表明，银杏内酯B能保护和改善缺血模型损伤的脑细胞，缓解心脏毒性。因此，银杏内酯B具有改善心肌缺血再灌注的神经保护作用[11]。本实验通过建立心肌缺血再灌注大鼠模型并采用银杏内酯B进行预处理，观察其对大鼠心肌梗死面积，血清TNF-α、IL-6水平，VEGF蛋白表达水平以及认知功能的影响，以期为银杏内酯B提供临床用药依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 随机选取雄性健康Wistar大鼠80只，体重200～250 g，分为假手术组、模型组、银杏内酯B低剂量组(低剂量组)、银杏内酯B高剂量组(高剂量组)，每组20只。低剂量组、高剂量组大鼠分别在造模前灌胃银杏内酯B 15 mg/kg、60 mg/kg，连续灌胃7 d，其他组大鼠灌胃同体积生理盐水。参照相关文献，采用冠状动脉结扎法制备心肌缺血再灌注损伤模型[12]。戊巴比妥麻醉大鼠后，连接呼吸机和心电图机，暴露心脏，剪开心包膜，于左冠状动脉前降支起始部结扎，心肌颜色由红变灰白，形成心肌缺血。心电图为ST段抬高持续30 min后松结扎线，恢复冠状动脉血流，心肌变为红色，ST段回落，形成缺血再灌注。假手术组只穿线不结扎。

1.2 避暗实验 采用避暗实验评价大鼠的认知功能[13]。造模24 h后进行该实验的适应性训练，依次将大鼠头朝外放入避暗箱的明室(无电击)，按照大鼠的趋暗习性则会进入到暗室，但是进入到暗室的大鼠会受到0.5 mA、5 s的电击，多次电击后大鼠会产生记忆不进入到暗室，训练期记录大鼠进入暗室的潜伏期(Retention-1)。次日进行测试，依次观察和记录各大鼠进入暗室前的潜伏期(Retention-2，从大鼠放入明室到第1次进入到暗室并电击的时间)和5 min内进入暗室的错误次数。行为学测试结束24 h后处死动物。

1.3 氮蓝四唑染色法测定心肌梗死面积 行为学测试后，麻醉大鼠取出心脏，将大鼠心室平行切成厚度相等的5片，再加入0.1%氮蓝四唑溶液中，37 ℃烘箱内染色15 min。染色后进行图像采集，灰白色为梗死心肌，蓝色为正常心肌。心肌梗死面积(%) = 梗死区面积/心室总面积×100%[14]。

1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)测定炎性因子TNF-α和IL-6水平 取出备用的心肌组织解冻，吸干多余水分和杂质后，称取重量；研磨后置于EP管中，4 ℃离心匀浆组织样本，取上清液，再进行蛋白定量；根据试剂盒说明书将标准品分别稀释为不同浓度；随后将样品依次加入样品孔中，盖上封板膜后37 ℃恒温箱孵育；稀释洗涤液进行洗涤，在各孔中加入酶标抗体，密封后进行孵育，再次重复上述洗涤过程；再加入显色试剂，密封并避光孵育；孵育后再滴加终止液终止反应。用酶标仪检测吸光度值，最后计算各标准曲线及各指标含量[15]。

1.5 蛋白质印迹法(Western Blot)测定VEGF蛋白表达水平 取大鼠脑组织备用，去掉多余组织残渣和血水，依次称重后按照说明书进行蛋白定量计算上样量。根据目的蛋白的分子量配制分离胶，用37 ℃烘箱孵育，冷却后加入浓缩胶插入齿梳，然后按照定量计算的上样量进行上样并电泳，再根据切胶转膜，封闭2 h后室温孵育一抗。次日进行洗涤，再室温孵育二抗2 h，同上述洗涤后显影成像，再进行灰度值扫描[16]。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积比较 与假手术组比较，模型组心肌梗死面积明显增加(P<0.01)，经不同剂量银杏内酯B治疗后，低剂量组、高剂量组心肌梗死面积较模型组明显缩小(P<0.05或P<0.01)，且高剂量组缩小更明显。详见表1。

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较(±s) 单位：%

2.2 各组炎性因子TNF-α、IL-6水平比较 与假手术组比较，模型组心肌组织炎性因子TNF-α和IL-6水平明显升高(P<0.01)，经不同剂量银杏内酯B治疗后，低剂量组、高剂量组心肌组织TNF-α和IL-6水平较模型组明显降低(P<0.05或P<0.01)，且高剂量组降低更明显。详见表2。

表2 各组炎性因子TNF-α、IL-6水平比较(±s)

2.3 各组大鼠心肌组织VEGF蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组心肌组织VEGF蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，经不同剂量银杏内酯B治疗后，低剂量组、高剂量组VEGF蛋白表达水平较模型组明显升高(P<0.05)，且高剂量组升高明显。详见图1。

A为假手术组；B为模型组；C为低剂量组；D为高剂量组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

2.4 各组大鼠的认知功能比较 训练期各组大鼠Retention-1比较差异均无统计学意义(P>0.05)，表明在行为学实验前各大鼠的基本状态无区别。次日的测试期，与假手术组比较，模型组大鼠进入暗室前的潜伏期Retention-2明显降低(P<0.01)，5 min内进入暗室的错误次数明显增加(P<0.01)；经不同剂量银杏内酯B治疗后，低剂量组、高剂量组Retention-2较模型组明显延长(P<0.05)，5 min内进入暗室的错误次数较模型组明显减少(P<0.05)。详见图2～图4。

图2 各组大鼠Retention-1比较

与假手术组比较，* P<0.01；与模型组比较，# P<0.05。

与假手术组比较，* P<0.01；与模型组比较，# P<0.05。

3 讨 论

心肌缺血后再灌注损伤指冠状动脉部分或者是完全急性梗阻之后，在一定时间内又重新获得再通的过程，虽然缺血的心肌能再恢复正常的灌注，但心肌组织损伤进一步加重[17]。脑血管疾病仍然是全球人群致残和死亡的第三大原因，且发病率逐年增加[18-19]。心肌缺血再灌注损伤严重影响病人的临床治疗效果和预后情况，而且发生机制极其复杂，比如氧化应激、炎症反应、血管新生等，多种发病机制互相联系和影响，最终造成心肌功能障碍和认知功能障碍[20]。

炎症细胞的聚集和炎性因子的释放为心肌缺血再灌注损伤的关键步骤。在炎症反应中，许多细胞因子得以释放，如TNF-α、IL-6等促炎因子，而TNF-α是激发心肌缺血再灌注损伤炎症反应的关键因子，可促进其他促炎细胞因子IL-6等的释放，也可诱发细胞黏附分子，导致急性心肌组织损伤[21]。另外，TNF-α也参与血管重构、阻碍心肌收缩，损害心肌功能。本实验结果同样显示，模型组心肌梗死面积和炎性因子TNF-α、IL-6水平明显高于假手术组(P<0.05)。血管新生是指从已存在的血管网中新生长出来的过程。VEGF是一种特异性的肝素结合生长因子，也是血管新生的关键因子，主要生物学作用为诱导血管新生。有研究表明，VEGF在体内可增加内皮的通透性，诱导血管的生成，也是一种重要的血管生成活性物质[22]。在缺血性脑血管相关疾病的血管新生治疗和预后中，VEGF发挥重要作用[23]。有研究表明，VEGF能修复和改善缺血再灌注损伤后的血管新生和脑神经保护[24]。本实验结果显示，模型组VEGF蛋白表达水平和认知功能明显低于假手术组(P<0.05)。

银杏内酯是中药银杏叶中的关键活性物质之一，主要包括银杏内酯A、B、C、M和白果内酯，均是血小板活化因子受体拮抗剂，具有抗氧化、抗炎、抗过敏、促血管新生、促学习记忆等多种生物学作用[25]。大量研究发现，银杏内酯B可清除缺血再灌注损伤中的自由基，降低微血管张力，缩小梗死面积[26-27]。本实验结果显示，心肌缺血再灌注大鼠经低、高剂量银杏内酯B治疗后，心肌梗死面积和TNF-α、IL-6水平明显降低(P<0.05或P<0.01)，VEGF蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，认知功能障碍明显改善(P<0.05)，但是高剂量银杏内酯B疗效更好。

综上所述，银杏内酯B可明显改善心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积和认知功能，其机制可能与降低炎症反应和促进血管新生有关，这可能是银杏内酯B治疗心肌缺血再灌注损伤疾病的重要分子机制之一，但是高剂量银杏内酯B疗效更明显。