猪肉生产链四环素抗性基因污染分布研究进展

□ 张程鹏 申元英 大理大学基础医学院

抗生素在农业生产和畜牧养殖上的应用极为广泛。我国是抗生素生产和使用大国。据统计，我国一年生产抗生素21万吨，其中有40%左右被用于禽畜养殖业[1]，尤其在鸡、鸭、猪的养殖中使用更为严重。四环素作为一种广谱抗生素广泛用于禽畜养殖业，用以预防和治疗动物疾病及促生长[2]。而抗生素大多未能被充分吸收，抗生素的滥用和对四环素污染处理工艺的缺乏使得环境中的抗生素残留浓度增加。残留的抗生素含量最高可达到mg/kg级水平。如：猪粪中检出四环素类药物的浓度高达59.06 mg/kg[3]。自然环境中的微生物种类、数量众多，环境中抗生素残留的增多大大增加了致病菌或条件致病菌获得抗生素抗性的机会，产生大量的抗性基因。

基因是遗传信息的载体，抗生素抗性 基 因（Antibiotic resistance genes,ARGs）即具有抗性的遗传因子[4],其赋予携带该基因的生物体以对抗生素的抗性。耐药基因有可能会通过直接接触或沿着食物链的污染等多种途径进入到动物体内,提高致病菌的抗生素抗药性,使得细菌感染性疾病的治疗难度更大，导致大量携带有ARGs的微生物出现，最终结果便是抗生素治疗效力的日益下降。目前已发现的四环素类抗性基因（Tet-R）的种类达到40种以上。抗性基因是抗性菌具有抗性的主要原因之一，抗生素抗性细菌对抗生素的耐药机理包括：细菌外膜不渗透性障碍、细菌外排泵系统、抗生素作用的靶位变化和抗生素的钝化失活等[5]。它可以通过多种形式的可移动遗传原件如质粒、整合子、转座子等通过基因水平转移机制（horizontal gene transfer，HGT）在微生物间、微生物与自然环境间转移传播[6]。

2014年，世界卫生组织发布的《全球抗生素耐药报告》明确指出抗生素抗性是21世纪公共卫生的严峻挑战，针对动物生产应监督和促进畜禽业的合理用药，并强调了食用动物的抗生素抗性及其在食物链的传播方面的数据缺乏，应加强此方面的研究[7]。我国目前正大力推行生猪养殖屠宰定点化，废水的生物处理、农田利用等公益模式。本研究通过查阅国内外文献，总结归纳了猪肉生产链中生猪养殖、屠宰、上市等环节中的猪肉、环境以及废弃物中四环素抗性基因污染情况，以期让更多人对生猪生产链中抗生素耐药性问题有更深入的认识，为养殖业抗生素耐药性风险评估提供一定的支持。

1 生猪生产链中四环素抗性基因分布情况

目前畜禽养殖业耐药菌的研究主要是与动物传染性疾病及人畜健康关系密切的病原菌。许多研究发现，生猪生产链中Tet-R的分布存在空间差异性和时间差异性。例如：Christina[8]等通过荧光定量PCR（q-PCR）对生产链中的猪肉进行检测，发现零售环节（5.58 log copies）的猪肉较屠宰场环节（2.38 log copies）的猪肉tet（M）浓度显著升高，且存在实质性差异。作者认为肠球菌应该是可能的病原体及tet（M）潜在受体，其他一些多见于革兰氏阴性菌群的抗性基因或在革兰氏阳性与革兰氏阴性菌之间有更高可交换程度的抗性基因，可能在生产链中会显示出相似的积累。Guillermo[9]等人利用宏基因组DNA序列的方法在生猪屠宰的“麻醉区”“动物到达区”均检测到了Tet-R，比如tet（B）、tet（Q）和tet（X）。Looft[10]等人的研究有类似的发现，虽在检出的35～62个ARGs中Tet-R仅有1～4个，但这可以用“猪肠道微生物受到多重抗生素的选择压力，对抗生素压力的抗性是由通用的外排泵机制而非特定的抗性基因驱动的”这一理论来解释。王学君[11]等人研究了从贵州省8个地区规模化养殖场分离的猪源大肠杆菌，发现其携带的四环素耐药基因的检出率为（41.50%～92.60%）。孟赫诚[12]等对生猪肉加工厂食品接触面进行Tet-R检测，存在9种四环素耐药基因，其中tet（L）的检出率最高，为7.7%，其次为tet（A）（6.0%）、tet（B）（4.8%）、tet（C）（4.8%）、tet（E）（3.6%）、tet（M）（3.6%）、tet（S）（3.6%）、tet（K）（1.2%）和tet（X）（0.6%）。所有分离菌无论对四环素敏感还是耐药都携带1种或多种耐药基因，这可能与基因选择性表达有关，同时可观察到生猪肉加工厂食品接触面Tet-R多为核糖体保护基因，与王珊珊[13]等人的研究结果类似。Rukayya[14]对接受常规农场治疗而未使用抗微生物剂的猪的粪便大肠杆菌的表型-基因型抗微生物耐药性（AMR）模式与常规使用抗生素超过70天的猪的比较，发现两组动物中均能检测出Tet-R（63.9%的分离物中发现至少一个四环素抗性基因），且在生长阶段也检测到了Tet-R，因此认为猪的ARGs可以在生长过程中的任何阶段形成，且与是否直接接触抗生素关系不是十分密切。

生产过程中产生的废弃物同样有很高的Tet-R检出。Cheng W等[15]利用荧光定量PCR方法对中国东南地区5省的16个养殖场中的5类抗生素（四环素类、磺胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类）的21种耐药基因进行定量调查，发现粪便样品中tet（M）基因是污染程度最重的基因之一，其相对丰度达到了copies/g，阳性率大于90%。土壤样品中tet（C）、tet（M）为优势基因，浓度高于copies/g。任雪丽[16]等对上海市松江区养猪场的猪粪耐四环素乳糖发酵型肠杆菌（TRLFE）进行四环素抗性基因检测，检测菌株总数的74.03%携带至少1种或2种Tet-R基因，样品的乳糖发酵型肠杆菌中tet（R）基因检出率范围为3.12%～96.87%。tet（A）和tet（B）在所有样品中均有检测到，与Al-Bahry SN[17]和Roberts[18]等的研究结果基本吻合。Tet-R的分布存在一定的时间分布特征，tet（S）则仅出现在9月份和11月份，tet（M）几乎在每个季度的猪粪中的TR-LFE中都有检测到，而所有样品中都没有检测到编码核糖体蛋白的tet（O）和tet（X）。在生猪养殖场废水中的情况则有所不同[19]，Cheng等[15]检测了猪场废水中的四环素抗性基因，发现编码核糖体蛋白的抗性基因（tetM、tetO、tetQ、tetW）比外排泵机制抗性基因（tetA、tetB、tetC、tetL）、编码使抗生素失活的修饰酶的抗性基因（tetX）的丰度更高，分别为9.25×、5.53×、1.69× copies/16S rRNA。Tao等检测了中国台湾6个猪场污水处理系统中的耐药基因，发现tetA、tetW（-）在所有样品中均被检出。

2 抗生素耐药性（antimicrobial resistance,AMR）常见分子生物学检测方法——聚合酶链式反应（PCR）

PCR是1980年代开发的技术，在分子生物学中应用广泛[20-21]。常规PCR包括3个步骤：在95 ℃下使双链DNA变性，在50～60 ℃下对PCR引物进行退火，以及在72 ℃下进行DNA延伸。结束后可通过琼脂糖凝胶电泳技术并用溴化乙锭或其他荧光DNA螯合染料对DNA染色来可视化PCR扩增的基因产物。

PCR技术发展迅速且已较成熟，一些进展如：实时PCR（RT-PCR）和等温扩增。实时PCR又称为定量PCR（qPCR），反应体系中存在有利于实时监测目标DNA序列扩增的荧光染料，因此在PCR后无须进行可视化电泳操作步骤，省时且更加安全[22]，越来越多的研究选用qPCR进行AMR检测。RT-PCR可以使用插入任何双链DNA的非特异性染料，或者由寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，这些寡核苷酸用荧光来报告基因标记，只有在探针与其互补序列杂交后才能进行检测顺序[23]。等温PCR（如LAMP和RPA）的特殊之处则在于整个过程在恒定的温度下进行，具有条件要求简单、资源要求低、适用于现场操作观察等特点。多重PCR在检测革兰氏阴性细菌中与头孢菌素或碳青霉烯[24]抵抗有关的β-内酰胺酶时也体现出了投入少、时间消耗少等优势。RT-PCR的优势在于可以检测特定基因中的点突变，而普通PCR则无法做到。q-PCR常常用于较短片段的检测，而常规PCR则能用于大片段的检测。PCR作为该领域的主要技术仍在蓬勃发展：Glocker等利用RT-PCR检测16S rRNA基因突变，且能够区分出野生型菌株和表现出单碱基对、双碱基对或三碱基对突变的抗性菌株[25]。

3 结论与展望

由于技术、经济、管理等各方面的限制，我国猪肉生产链中Tet-R污染严重，耐药基因分布存在一定的空间分布特征和时间分布特征。在养殖环节，废弃物未能得到妥善处理，废水大多直接排放或进行简单处理即排放，急需新的能够降低废水中ARGs残留的废弃物处理工艺；生猪粪便多采用简单堆放风干处理，少数进行堆肥或发酵处理。堆肥能有效降低有机肥料中的四环素抗性基因残留，但是也增加了向土壤中播撒ARGs的风险。从屠宰到生产零售环节，由于加工面的污染，也使得猪肉中Tet-R的污染情况增加。由于四环素在猪肉产业链中作为促生长剂和抑菌药而占据重要地位，Tet-R的污染情况十分值得关注，针对此现状本文提出如下建议：①避免创造适于抗性基因选择、动员和储存的环境。如：制定粪便堆肥的相关技术指标，改良污水处理工艺等。②阻断耐药菌向致病微生物组的扩散途径。制定关于农业废弃物排放的法律法规，减少农业废弃物的使用，从而降低环境中的ARGs传播给人类、粮食作用和野生生物的风险。③限制抗药性病原体的选择压力，对人和动物谨慎使用抗生素。优化牲畜的生活条件，以减少中国食用动物的抗生素消耗；临床上规范合理用药等。④建立完善健全的监测管理系统。从Tet-R的多样性可见，还有更多的抗性基因可供病原体吸收。即使没有直接的抗生素选择压力，Tet-R仍然有出现的可能，并且已存在的Tet-R不可能被消除。在病原体中出现的新的ARGs有可能会给人类健康、畜牧业等带来毁灭性的打击。因此在国家积极引导以及科研人员密切配合下建立标准统一的，免费共享的，定期更新的监测管理系统是控制抗生素污染的重要措施。