基于网络药理学预测金钱草治疗泌尿系结石的作用机制

黄丽， 孙晓静， 孙治中， 陈慧玲， 谢建兴， 崔学教

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

泌尿系结石是常见的泌尿系统疾病，据统计，全世界泌尿系结石的发病率已达11%～15%[1]，且有逐年升高的趋势。虽然体外冲击波碎石、经皮肾镜碎石取石、输尿管镜碎石取石等微创手术已经广泛采用并取得较好的治疗效果，但泌尿系结石的复发率仍比较高[2]。中医药治疗泌尿系结石有良好的疗效。崔学教教授认为，治当 “唯重利尿”，同时也特别注意固护正气。通淋排石药多为寒凉之品，久服必伤阳气，故崔老临证运用利尿之法，多首选药性较平的金钱草。金钱草是治疗泌尿系结石的常用中药，具有抗结石生成、利尿、抗炎和减轻输尿管张力的作用。但目前针对金钱草的研究局限于单一成分、单靶点，其具体机制尚不明确。网络药理学是在生物信息学、多向药理学[3]、系统生物学[4]的基础上，通过多成分-多靶点-多通路更加系统地探讨中药及方剂对相关疾病作用机制的研究方法[5]。故本研究基于网络药理学预测金钱草治疗泌尿系结石的靶点、通路富集分析以探讨其作用机制，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1活性成分的获取以 “金钱草” 为检索词，通过中药系统药理学技术平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索其化学成分，将口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 作为活性成分筛选条件，筛查出符合条件的活性成分，点击其成分的详细信息，保存活性成分的2D结构。

1.2预测金钱草相关靶点在Pubchem 中检索筛选出的活性成分，找出它们对应的smile 号，保存为SDF 文件，上传至SwissTargetPrediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）， 基 于 反 向分子对接原理，依据成分的2D/3D结构进行靶点预测，得到金钱草的预测靶点。

1.3泌尿系结石相关靶点的获取及与金钱草预测靶点的映射以 “Urinary Calculus” 为检索词，通过GeneCards数据库获取泌尿系结石相关靶点。将金钱草的预测靶点与泌尿系结石相关靶点进行映射得到金钱草治疗泌尿系结石的预测靶点。

1.4蛋白质相互作用（PPI）网络的构建通过String 数据库设定物种为 “Homo snpiens” 获取全部蛋白-蛋白相关作用关系，导入Cytoscape 3.6.0软件，生成背景网络。在背景数据库选中上述映射得到的金钱草作用于泌尿系结石的靶点，并找到与其直接相连的节点，作为金钱草治疗泌尿系结石的PPI网络。

1.5 Hub网络的提取通过Cytoscape 3.6.0 软件Tools 模块中NetworkAnalyzer- Network Analysis-Analyze Network 进行网络分析获取相关拓扑参数，选取节点连接度（Degree）的二倍中位数、节点介度（Betweenness）和节点紧密度（Closeness）的中位数作为筛选依据，提取出Hub网络。

1.6基因本体论（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析应用Cytoscape 3.6.0 软件中的ClueGO 插件，选择BiologicalProcess（生物进程），对Hub网络中的靶标进行GO富集分析。通过DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）网站对上述分析结果进行KEGG通路分析并进行筛选，得到显著富集（P＜0.01）的通路，并按照基因（Gene）数从大到小排序，结合文献检索，筛选出治疗泌尿系结石的可能通路，找到其通路上的相关靶标。结合金钱草的活性成分，构建出金钱草活性成分-泌尿系结石靶标-KEGG通路的网络图。将筛选出来的20 条相关通路，绘制成KEGG 通路富集分析柱状图。

1.7分子对接验证成分与靶点的结合能力运用systems Dock 网 站（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）对Degree值排名前5位的预测靶标与金钱草活性成分进行分子对接，通过比较与原生配体的结合分值大小来评价结合的稳定性。

2 结果

2.1金钱草活性成分本研究将OB ≥30%、DL ≥0.18 作为活性成分筛选条件，筛选出活性化合物10 种，化合物名称、相关参数及化学结构式见表1。

表1 金钱草活性成分Table 1 Data of active ingredients from Herba Lysimachiae

2.2金钱草预测靶点以及活性成分-泌尿系结石靶点网络构建在SwissTargetPrediction 数据库中筛选出10 种活性化合物对应的135 个靶点，依据成分的2D/3D 结构进行靶点预测，筛选出98 个靶点作为金钱草的预测靶点。将所得的金钱草预测靶点与GeneCards 数据库获取的1 043 个泌尿系结石相关靶点相映射，筛选出金钱草可能与泌尿系结石相关的靶点21个。在Cytoscape 3.6.0软件中导入金钱草的活性成分与泌尿系结石相关的靶点，构建金钱草活性成分-泌尿系结石靶点网络图（见图1）。如图1 可见，此网络中共包括76 个节点，其中，包括9个化合物，21个靶点，91个边。

图1 金钱草活性成分-泌尿系结石靶点网络图Figure 1 Network of Herba Lysimachiae active ingredients- urinary calculus targets

2.3 PPI网络的构建将21 个金钱草可能与泌尿系结石相关的靶点导入String 数据库得到蛋白-蛋白相关作用关系，通过Cytoscape 3.6.0 软件，形成金钱草治疗泌尿系结石的PPI网络（见图2）。如图2显示，此网络中共包括192 个节点，965 个边。图中节点大小是按Degree 值的大小形成，Degree 值越大，节点越大。

图2 金钱草治疗泌尿系结石的PPI网络Figure 2 PPI network of Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.4 Hub网络的提取及Hub中的靶标选取Degree的二倍中位数、Betweenness 和Closeness 的中位数作为筛选依据，通过Cytoscape 3.6.0 软件得到Hub中的靶标，即金钱草治疗泌尿系结石的关键靶点，提取出Hub 网络（见图3）。关键靶点共8 个，按照Degree 值从大到小排序分别为表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体1（ESR1）、醛糖还原酶（AR）、表皮生长因子受体2（ERBB2）、雌激素受体2（ESR2）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、肝X受体β（NR1H2）、血清钙（CA2）。

图3 金钱草治疗泌尿系结石的Hub网络Figure 3 Hub network of Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.5 GO富集分析应用Cytoscape 3.6.0 软件中ClueGO插件，进行GO富集中的生物进程分析，得到11 个功能组别（见图4）以及其占比饼状图（见图5）。

图4 金钱草治疗泌尿系结石GO富集分析功能组别图Figure 4 Diagram for GO enrichment analysis of functional groups Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

图5 金钱草治疗泌尿系结石的GO富集分析功能组别占比饼状图Figure 5 Pie chart for GO enrichment analysis of functional group proportion in Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.6 KEGG通路分析通过KEGG 通路分析得到126条通路，结合文献检索，筛选出金钱草治疗泌尿系结石的可能通路为8条，绘制KEGG通路的网络图（见图6）。主要分为2 类：①泌尿系炎症及黏膜相关通路：磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信号通路、血趋化因子信号通路、核因子E2相关因子2/ Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Nrf2/Keap1）信号通路、p38 丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信号通路、酪氨酸激酶/信号转导和转录激活子（JAK/STAT）信号通路等；②尿钙相关通路：核因子κB（NF-κB）信号通路、辣椒素受体5（TRPV5）信号通路。

图6 金钱草治疗泌尿系结石的KEGG通路富集分析柱状图Figure 6 Histogram for KEGG pathway enrichment analysis of Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.7构建金钱草活性成分-泌尿系结石靶标-KEGG通路的网络图将上述8条相关通路，找到其通路上的相关靶标，结合金钱草的活性成分，构建出金钱草活性成分-泌尿系结石靶标-KEGG通路的网络图（见图7）。

2.8分子对接运用systems Dock 网站对Degree值排名前5位的预测靶标与金钱草活性成分进行分子对接，根据Docking Score值的大小应用GraphPiad Prism 7.0 软件制作出热图（见图8）。Docking Score值在4.25 以上认为分子与靶点有一定的结合活性，大于5.0 说明有较好的结合活性，大于7.0 说明具有强烈的结合活性。热图结果显示，大部分Docking Score值高于4.25，提示金钱草活性成分与预测靶标有一定的结合能力。

图7 金钱草活性成分-泌尿系结石靶标-KEGG通路的网络图Figure 7 Multiple compound-target-pathway network of Herba Lysimachiae

图8 金钱草治疗泌尿系结石预测靶标及活性成分分子对接热图Figure 8 Molecular docking heat map for predicted targets and active components

3 讨论

目前，针对金钱草治疗泌尿系结石的研究局限于单一成分、单靶点，其具体机制尚不明确，本研究运用网络药理学从分子水平对其作用机制进行探讨分析。

3.1金钱草治疗泌尿系结石的关键靶点预测结果表明，金钱草治疗泌尿系结石的关键靶点有8 个，具体为EGFR、ESR1、AR、ERBB2、ESR2、MMP-2、NR1H2、CA2。有研究表明：EGFR 能延缓肾小管细胞的坏死程度，在肾损坏中起保护性作用[6]；ESR1 能抑制草酸引起的肾小管上皮细胞氧化应激损伤及抑制结石相关炎症介质的表达[7]；AR活性升高，会导致肾脏细胞内信号转导通路发生改变，进一步加重肾脏功能损害[8-9]；ERBB2 在肾脏纤维化中发挥着重要的作用[10]；在结石导致的急性肾功能损伤中，MMP-2 及炎症介质表达上调，血液水平上升，参与炎症反应及肾小球、肾小管基底膜的降解[11]；CA2升高，尿钙沉积，是肾结石形成的重要原因之一，长期高钙血症可能造成肾小管功能失衡[12]。

3.2金钱草治疗泌尿系结石的炎症及黏膜相关通路金钱草治疗泌尿系结石的炎症及黏膜相关通路有PI3K-Akt 信号通路、血趋化因子信号通路、Nrf2/Keap1 信号通路、P38MAPK 信号通路、JAK/STAT 信号通路等。PI3K /Akt 信号通路在调节细胞存活、增殖和凋亡中起重要作用[13]。多种酶、细胞因子、蛋白等通过调节PI3K /Akt 信号通路在抑制炎性反应及血管增生中发挥抗肾小球足细胞衰亡的作用，从而达到修复急性肾功能损伤的功效[14]。血趋化因子不仅可以介导趋化、诱导细胞粘附、促进细胞生长，还具有参与全身炎症免疫反应等生物学功能[15]，故其可能具有调节泌尿系结石引发的肾盂肾炎的作用。Kong等[16]研究发现，Nrf2基因缺失不仅可以加重单纯输尿管梗阻引起的肾损害，还可以在后期加重肾纤维化的进程，同时，Nrf2除了抑制氧化应激反应，进而下调肾脏炎症反应以外，还可直接抑制NF-κB 介导的炎症反应[17-18]。P38MAPK信号通路影响草酸、草酸钙晶体诱导的大鼠肾脏氧化应激和炎症损伤反应、肾脏局部RAS 系统改变、肾脏紧密连接的改变，从而起到抑制草酸钙结石生成和保护肾功能的作用[19]。JAK/STAT 信号通路是介导炎症反应的重要信号通路之一，在多种泌尿系疾病包括泌尿系结石中具有调控作用[20]。

3.3金钱草治疗泌尿系结石的尿钙相关通路金钱草治疗泌尿系结石的尿钙相关通路包括NF-κB信号通路、TRPV5 信号通路。卢宇超[21]研究表明，通过激活NF-κB 信号通路，引起其下游黏附分子增加，从而介导草酸钙晶体在肾小管上皮细胞胞膜表面的粘附及增长。TRPV5 信号通路在调控尿钙水平中发挥重要的作用[22]，TRPV5的表达与尿钙与泌尿系结石的发生率成负相关[23]，其表达下降或缺乏可使肾小管对钙的重吸收减少，进而产生高钙尿，尿钙饱和析出，形成泌尿系结石。

综上所述，本研究采用网络药理学筛选金钱草的主要成分，并对靶标、通路进行功能分析，最后采用分子对接技术验证金钱草与泌尿系结石关键靶点的结合，预测了金钱草治疗泌尿系结石的分子作用机制。结果显示：金钱草通过多靶点、多通路治疗泌尿系结石，可能在炎症及黏膜相关通路、尿钙相关通路上起作用。基于此，今后在临床中可进一步研究金钱草在泌尿系感染、结石成分破坏与分解方面的作用机制，并进行金钱草制剂的开发工作。另外，在现代中药复方中普遍存在 “多向药理学” 效应和 “叠加” 效应，也可对中药复方的组成、质量控制和作用机制进行进一步深入研究。