香樟树叶水提物对三七根腐病菌的抑制

顾丽莎， 贾正燕， 张啸， 王昌梅,3， 吴凯,3， 张无敌,3， 尹芳,3

(1.云南师范大学，云南 昆明 650500；2.云南康艺三七种植有限公司，云南 昆明 650032；3.吉林东晟生物质能工程研究院，吉林 通化 134118)

1 引言

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科植物，又名田七、人参三七、参三七及金不换等[1]，主要分布在广东、广西、云南和四川等地[2]，喜温暖而阴湿的环境.三七植株主要由根茎叶组成，传统以根入药[3]，是我国特有的中药材，但三七根腐病严重影响了三七的产量和质量.研究显示，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)等是引起三七根腐病的主要病原菌[4-7].

香樟树(Cinnamomumcamphora(L.)Presl)是樟科( Lauraceae )樟属(Cinnamomum)常绿大乔木，为亚热带常绿阔叶树种，又名樟树、乌樟、樟木、油樟及芳樟.我国樟树资源丰富，主要生长于海南、四川、重庆、云南、福建、贵州和浙江等省区[8].吴传茂等人[9]研究了樟树叶乙醇提取物的抑菌作用，胡生辉等人[10]研究了樟树叶水提物对木材腐朽菌的抑制作用，马英姿等人[11]用杯碟法研究了樟树叶精油对4种供试菌的抑制作用，这些研究均表明香樟树叶提取物具有抑菌作用.

在三七根腐病菌的抑制方面，马玉楠等人[12]研究了黄花蒿和丁香挥发油对三七病害的抑制作用，赵雅萌等人[13]研究了黄花蒿叶水提物对尖孢镰刀菌的抑制作用，刘海娇等人[14]研究了油菜挥发油对三七根腐病菌的抑制作用，刘继红等人[15]研究了沼液对三七根腐病菌的抑制作用;鉴于目前还没有学者研究香樟树叶提取物对三七根腐病的抑制作用，本实验将研究香樟树叶水提物对三七根腐病菌中的尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的抑制效果.

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 香樟树叶

实验用香樟树叶为云南师范大学校园内刚修剪下来的香樟树叶.

2.1.2 三七根腐病菌

由云南省农村能源工程重点实验室提供的三七根腐病菌中的尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌.

2.1.3 仪器

SHZ-D循环水式真空泵、GMSX-280手提式高压蒸汽灭菌锅、电子天平、移液器、隔水式恒温培养箱、鼓风干燥箱、水浴锅、电磁炉、超净工作台、纱布、烧杯、培养皿、量筒、冷凝管、磨口牛角管、磨口接液瓶、打孔器、接种环、镊子、玻璃棒和分液漏斗等.

2.1.4 主要试剂

PDA培养基、葡萄糖和琼脂条.

2.1.5 培养基

PDA培养基[16]制作方法：将去皮后的马铃薯200 g切成小块，加入1 000 mL水，小火煮30 min，过滤，在滤液中依次加入葡萄糖20 g、琼脂条10 g并120 ℃加热搅拌，溶解后加水至1 000 mL，趁热分装，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却后倒入培养皿中.

2.2 实验方法

2.2.1 三七根腐病菌的培养

在提前准备好的PDA培养基上接种三七根腐病菌中的尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌，放到温度为30 ℃的恒温培养箱中，培养4-6 d，直到整个培养基中长满菌落.

2.2.2 香樟树叶的处理方法

将新鲜香樟树叶剪碎后做以下处理：

(1)香樟树叶水提物的制备

使用电子天平准确称取等量剪碎的香樟树叶，分别在室温和80 ℃提取，具体方法如下：

①室温提取：取剪碎的香樟树叶，加入10倍质量的蒸馏水，室温下浸泡48 h，用纱布过滤，取滤液，标记备用.

②80 ℃提取：取剪碎香樟树叶，加入10倍质量蒸馏水，置于1 L的圆底烧瓶中，80 ℃水浴4 h，用纱布过滤，取滤液，标记备用.

(2)香樟树叶挥发油的制备

将剪碎的香樟树叶和10倍质量的蒸馏水置于1 L的圆底烧瓶中，使用减压蒸馏装置蒸馏，收集蒸馏出液，倒入分液漏斗中，静置分层，分离出油层，得浅黄色油状液体.

2.2.3 抑菌试验方法

用移液器量取500 μL香樟树叶水提物，加到提前准备好的PDA培养基表面，用三角不锈钢棒在培养基表面涂布均匀，再用灭菌的打孔器(Φ=9 mm)从培养好的菌种中均匀的截取Φ=9 mm的菌块，取3个菌块接种在培养基中，每个实验组各做3个平行，对照实验加入500 μL无菌水.将接种完的培养皿放入30 ℃的条件下培养箱中培养4 d，每隔24 h观察菌块，用十字交叉法测量菌块的直径并记录.

2.2.4 数据处理方法

采用菌丝生长速率法计算菌丝生长抑制率[17-18].记对照平板培养基菌落直径为Ra，处理平板培养基菌落直径为Rb，则

2.2.5 实验方法

2.2.5.1 不同温度处理后的香樟树叶水提物对三七根腐病菌的抑制效果研究

取室温提取的香樟树叶水提物(A组)做如下处理：

B组：将A组水提物放入圆底烧瓶在60 ℃水浴锅中水浴30 min；

C组：将A组水提物放入圆底烧瓶在90 ℃水浴锅中水浴30 min；

D组：将A组水提物放入高压蒸汽灭菌锅在121 ℃处理30 min；

将香樟树叶室温水提物以及经过60 ℃水浴、90 ℃水浴、121 ℃处理的室温水提物各取500 μL分别进行抑菌试验.

2.2.5.2 不同方法提取的香樟树叶水提物对三七根腐病菌的抑制效果研究

将香樟树叶室温水提物、80 ℃水提物和香樟树叶挥发油各取500 μL分别进行抑菌试验.

3 结果与分析

3.1 不同温度处理后得到的香樟树叶水提物对三七根腐病菌的抑制效果

3.1.1 对尖孢镰刀菌的抑制效果

取香樟树叶室温水提物以及进行60 ℃水浴、90 ℃水浴和121 ℃处理后得到的香樟树叶水提物对尖孢镰刀菌作抑菌试验，抑制效果如图1.

图1 不同温度处理后得到的香樟树叶水提液对尖孢镰刀菌的抑制效果

由图1可看出，不同条件处理所得香樟树叶水提物对尖孢镰刀菌呈现出不同的抑制效果，且随着时间的增加，抑制能力逐渐增强.经过60 ℃处理后得到的香樟树叶水提物抑制作用最好，第4天抑菌率达到63.45%；第4天时，未经处理的室温水提物抑制作用比经过90 ℃处理的香樟树叶水提物抑制作用略好，未经处理的室温水提物抑菌率达到47.69%，经90 ℃处理的香樟树叶水提物抑菌率达到41.18%；经过121 ℃处理的香樟树叶水提物对尖孢镰刀菌无明显的抑制作用.

3.1.2 对腐皮镰孢菌的抑制效果

取香樟树叶室温水提物及进行60 ℃水浴、90 ℃水浴、121 ℃处理后得到的香樟树叶水提物对腐皮镰孢菌作抑菌试验，抑制效果如图2.

图2 不同温度处理得到的香樟树叶水提液对腐皮镰孢菌的抑制效果

由图2可看出，未经处理的室温水提物与经60 ℃、90 ℃和121 ℃处理后的香樟树叶水提物对腐皮镰孢菌呈现不同的抑制效果.经过90 ℃处理后得到的香樟树叶水提物抑制作用最好，第4天抑菌率达到69.05%；经过60 ℃处理的香樟树叶水提物的抑制效果与未经处理的室温水提物的抑制效果相近，第4天抑菌率分别达到42.86%和41.67%；但经过121 ℃处理后的香樟树叶水提物对尖孢镰刀菌无明显的抑制作用.

不同温度处理的香樟树叶水提物对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌呈现不同的抑菌效果，原因可能是在一定温度范围内随着温度的升高，原提取液中某些物质被分解为抑菌成分，但随着温度的继续升高，抑菌活性物质被破坏.

3.2 不同方法提取的香樟树叶水提物对三七根腐病菌的抑制效果

3.2.1 对尖孢镰刀菌的抑制效果

取香樟树叶室温水提物、80 ℃水提物和香樟树叶挥发油对尖孢镰刀菌作抑菌试验，抑制效果如图3.

图3 香樟树叶提取物对尖孢镰刀菌的抑制效果

由图3看出，室温水提物、80 ℃水提物和香樟树叶挥发油对尖孢镰刀菌呈现不同的抑制作用，随着时间的增加，香樟树叶挥发油和室温水提物抑菌作用逐渐增强.其中，抑菌效果最好的为香樟树叶挥发油，第4天抑菌率达到77.31%；室温水提物的抑菌率明显高于80 ℃水提物的抑菌率，二者第4天时抑菌率分别为47.69%和27.52%.

3.2.2 对腐皮镰孢菌的抑制效果

取香樟树叶室温水提物、80 ℃水提物和香樟树叶挥发油对腐皮镰孢菌作抑菌试验，抑制效果如图4.

图4 香樟树叶提取物对腐皮镰孢菌的抑制效果

由图4看出，室温水提物、80 ℃水提物和香樟树叶挥发油对腐皮镰孢菌呈现不同的抑制效果，香樟树叶挥发油和80 ℃水提物抑菌率随着时间的增加而增大.香樟树叶挥发油对腐皮镰孢菌呈现出最好的抑制作用，第4天抑制率达到74.29%；室温水提物的抑制作用与80 ℃水提液的抑制作用相近，第4天抑制率分别为42.86%和41.43%.

香樟树叶室温水提物、80 ℃水提物和香樟树叶挥发油对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌呈现不同的抑菌能力，其原因可能是不同条件得到的香樟树叶水提物的抑菌活性物质成分含量有差异.香樟树叶中提取的挥发油对三七根腐病病菌的抑制作用最好，可能是挥发油中含有较高的抑菌活性成分.上述实验表明，香樟树叶内含有天然抑菌活性成分，在实际农业种植病害防治中，可以添加适量的香樟树叶水提液来防治三七根腐病.

4 结语

实验研究了香樟树叶水提物对三七根腐病菌的抑制作用，设计了不同方法提取的和不同温度处理后的香樟树叶水提物对三七根腐病原菌中的尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的抑制试验，实验结果如下:

(1)经过60 ℃处理后得到的香樟树叶室温水提物对尖孢镰刀菌抑制作用最好，抑菌率达到63.45%；经90 ℃处理后得到的香樟树叶室温水提物对腐皮镰孢菌抑制作用最好，抑菌率达到69.05%，而121 ℃处理后的香樟树叶室温水提物对三七根腐病菌的抑制作用很小.

(2)香樟树叶挥发油对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的抑菌试验呈现出最好的抑制效果，抑菌率分别达到77.31%和74.29%；室温水提物对三七根腐病菌的抑制效果比80 ℃水提物略好，抑制率分别达到42.86%和41.43%.说明不同条件得到的香樟树叶提取物对三七根腐病菌有不同的抑制效果.

本实验充分说明了香樟树叶提取物对三七根腐病菌有很好的抑菌效果，为植物农药的开发奠定一定的基础.