QuEChERS-HPLC-MSMS快速测定牛奶中的喹诺酮类兽药残留

韩臣波

（新疆天润生物科技股份有限公司，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐830088）

牛奶含有人体所需的全部营养物质，随着人类生活水平的提高，人类对牛奶的需求日益增加，对牛奶安全和质量的控制尤为重要。喹诺酮类药物对支原体、衣原体、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和结核杆菌具有明显的抑制作用，因此，这类药物被广泛应用于人类及动物细菌性感染疾病的预防和治疗[1，2]。有研究表明，喹诺酮类药物的滥用会导致动物微生物的耐药性增强[3,4]，并可能对人体造成肝肾功能损伤和神经中毒等不良反应[5,6]，因此，加强对牛奶中喹诺酮类兽药残留的监测具有重要意义。我国农业部235号公告规定牛奶中恩诺沙星和达氟沙星的最大残留限量分别为100μg·L-1和30μg·L-1。

目前，喹诺酮类兽药残留的分析一般采用酶联免疫法（ELISA）[7,8]、高效液相色谱法[8,9]和液相色谱质谱法[8,10]，也有部分文献采用薄层色谱法[11]和毛细管电泳法[12]。HPLC-MSMS法灵敏度高，特异性强，测定结果准确可靠，近年来已经广泛应用于食品中的兽药残留检测。本试验采用近年来在兽药残留检测中日渐广泛的QuEChERS样品前处理净化方法，结合高效液相色谱串联质谱仪，建立了牛奶中喹诺酮类兽药残留的快速测定方法，测试结果令人满意[13,14]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Altus LC-30型高效液相色谱串联质谱联用仪（美国Perkin Elmer公司）；N-EVAP-12型氮气浓缩仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；3K15型台式高速离心机（德国SIGMA公司）；Vortex 2-032015型涡旋混合器（德国IKA公司）；ZORBAX SB-C18型色谱柱（4.6mm×150mm，5μm）（美国Agilent公司）。

标准物质：达氟沙星（纯度99.8%，CAS 112398-08-0），恩诺沙星（纯度99.9%，CAS 93106-60-6），司帕沙星（纯度99.4%，CAS 110871-86-8），均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；环丙沙星（纯度98%，CAS 85721-33-1），双氟沙星（纯度99.1%，CAS 98106-17-3），沙拉沙星（纯度98%，CAS 98105-99-8），均购自百灵威科技有限公司。

甲醇、乙腈：HPLC级，德国Merck公司；甲酸、乙酸，优级纯，国药试剂有限公司；屈臣氏纯净水。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 称取牛奶试样4g，置于50mL聚四氟乙烯管中，加入含5%乙酸的乙腈溶液20mL，涡旋1min使之充分混合，加入4g NaCl，用均质器均质2min。4℃下8000r·min-1离心5min，准确量取上清液10.0mL，40℃水浴旋转蒸发至近干，用N2流吹干。准确加入1.0mL初始流动相溶解残渣，并转移至装有50mg-NH2和50mg PSA的2mL离心管中，涡旋混合1min，于4℃8000r·min-1下离心4min，上清液经0.22μm PTFE滤膜过滤至进样瓶中，用HPLCMSMS测定，以外标法计算各喹诺酮组分的含量。

1.2.2 标准曲线的配制 用乙腈将各标准物质配制成1mg·mL-1的标准储备液，分别准确吸取达氟沙星、恩诺沙星、司帕沙星、环丙沙星、双氟沙星和沙拉沙星标准储备液1.00mL至同一10mL容量瓶，用乙腈稀释至刻度，配制成100μg·mL-1的混合标准储备液，然后用2%的甲酸乙腈溶液将100μg·mL-1的混合标准储备溶液逐级稀释成1.00μg·mL-1的混合标准中间液，然后用按1.2.1步骤处理阴性样品的样品提取溶液将1.00μg·mL-1的混合标准中间液稀释成1.00、5.00、10.00、20.00和50.00ng·mL-1的标准曲线系列，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3 仪器条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1×150mm,8μm），柱温30℃，进样量5μL，流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈，流速0.3mL·min-1，梯度洗脱见表1。

表1 高效液相色谱梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure of HPLC

正离子模式，离子化喷雾电压4500V，离子源温度400℃，质谱接口加热气温度300℃，雾化器温度150μm·min-1，反吹干燥气100μm·min-1，多反应监测（MRM）参数见表2。

表2 喹诺酮类药物质谱分析参数Tab.2 Analysis parameters of quinolones by mass spectrometry

2 结果与分析

2.1 前处理方法优化

牛奶中含有大量蛋白质、脂肪等大分子物质，基质相对复杂，本试验比较了乙腈和甲醇对牛奶中6种喹诺酮类药物的提取效果，发现两者的提取效果差别不大，但乙腈对牛奶中的蛋白质沉淀效果更佳，更有利于净化，试验发现在乙腈中加入5%的乙酸酸化有利于目标组分在基质中的解离，明显提高目标物的回收率，因此，试验采用5%乙酸酸化的乙腈作为提取溶剂。

经过溶剂萃取后提取液中存在少量脂肪酸、酚类、碳水化合物等杂质，因此一般采用固相萃取净化后，才能有效检测样品中的喹诺酮类兽药残留。QuEChERS方 法 一 般 采 用PSA、C18、GCB、NH2、Al2O3等作为分散固相萃取材料。本实验针对牛奶样品基质，采用PSA+NH2作为分散固相萃取材料可去除牛奶中较多脂类和固醇类干扰，同时去除极性有机酸、酚类和某些糖类杂质，净化效果最佳，并能够获得较高的回收率。通过实验优化选择50mg NH2和100mg PSA作为分散固相萃取材料时，能够达到较好的样品净化效果，又能保证较高的目标物回收率。

图1 为空白牛奶阳性添加（8μg·kg-1）样品的色谱图。

图1 空白牛奶阳性添加样品中6种氟喹诺酮类药物色谱图Fig.1 Chromatograms of six fluoroquinolones in the positive samples of blank milk

从图1中可见，在该仪器条件下，用50mg-NH2和100mg PSA净化后，样品中的6种氟喹诺酮药物无杂质峰干扰，色谱分离效果良好。该方法明显缩短了样品前处理时间和步骤，减少了有机溶剂的用量，而且简单、快速、有效，能够满足牛奶中6种喹诺酮类药物残留的分析要求。

2.2 标准曲线及检出限和定量限

表3 为6种喹诺酮类药物的标准曲线、相关系数、检出限和定量限。

由表3可知，6种喹诺酮类药物在1.00～50.00μg·L-1范围内线性关系良好，线性相关系数R2均大于0.998，以3倍信噪比为样品中喹诺酮类药物的检出限，10倍信噪比为定量限，6种喹诺酮类药物的检出限为0.38～0.50μg·kg-1，定量限为1.25～1.66μg·kg-1，均优于GB/T 21312-2007方法中的参数水平，说明该方法的灵敏度完全满足牛奶中喹诺酮类药物的分析要求。

2.3 方法回收率和精密度

选用空白牛奶做加标回收试验，将500mL样品装入1L棕色玻璃瓶，准备3份空白样品，添加6种喹诺酮类药物混合标准溶液使样品中各喹诺酮类药物组分的浓度分别为1.0、5.0和10.0μg·kg-1，摇匀待测。每个加标浓度每次做6个平行试验，按1.2步骤处理样品，分别考察本方法的回收率和精密度，结果见表4。

表4 牛奶中6种喹诺酮类药物的回收率和精密度（n=6，%）Tab.4 Recovery and precision of six quinolones in milk（n=6，%）

表3 6种喹诺酮类药物的标准曲线、相关系数、检出限和定量限Tab.3 Standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of six quinolones

从表4可以看出，用本文QuEChERS方法提取和净化牛奶中的6种喹诺酮类化合物，平均回收率为88.2%～106.2%，精密度均为3.9%～9.7%，两项方法学参数均优于GB/T 21312-2007，说明本方法准确度和稳定性良好，能够满足牛奶中6种喹诺酮类药物的检测要求。

2.4 实际样品分析

从某大型超市选购25批次不同品牌的牛奶样品做实际样品测试，每个样品做两次平行试验，分别用QuEChERS和GB/T 21312-2007固相萃取法处理样品，做方法比对分析，结果表明，只有2个样品检出环丙沙星，浓度分别为17.2和11.4μg·kg-1，采用GB/T 21312-2007固相萃取法在25批样品中同样只在这两个样品中检出环丙沙星，浓度分别为15.9和12.1μg·kg-1，两种方法定性结果完全一致，定量结果的方法间精密度＜10%，说明本文QuECh－ERS方法的准确度可以满足实际牛奶样品中6种喹诺酮类药物的检测要求。

3 结论

本文采用QuEChERS结合高效液相色谱串联质谱联用法测定牛奶中6种喹诺酮类药物残留，用5%乙酸酸化的乙腈溶液提取牛奶中的目标组分，100mg PSA+50mg-NH2进一步去除样品提取液中的脂类、蛋白和固醇类等杂质干扰，实际样品分析结果表明本文QuEChERS方法能够获得与GB/T 21312-2007固相萃取方法一致的检测结果。综上所述，本文QuEChERS方法能够满足牛奶中6种喹诺酮类药物残留检测工作的要求，且比国标中固相萃取法更为简便，缩短了分析时间，节约成本，更适用于大批量样品的检测分析。