园林绿化废弃物堆肥对铅、锌污染土壤上小白菜生理特性的影响

马其雪，孙向阳，李素艳，李 松，刘源鑫，周文洁

(北京林业大学 林学院，北京 100083)

随着工农业生产的快速发展，重金属污染问题日益凸显。铅和锌是污染环境的主要重金属，据2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，铅、锌的点位超标率分别达到了1.5%和0.9%[1]。蔬菜种植区受铅、锌污染的问题尤为严重[2]，土壤中过量的铅、锌会迁移到蔬菜中[3]，引起蔬菜生理特性的改变。有研究表明，铅、锌可以与小白菜叶片中的叶绿素结合，造成叶绿素正常结构和功能的损坏，影响其光合作用，从而对小白菜生长产生不利影响[4]。铅、锌胁迫还会导致蕹菜体内活性氧代谢的平衡被破坏，体内抗氧化酶活性下降，严重影响蕹菜品质[5]。

施用土壤改良剂，可以固定土壤中的铅、锌，减轻铅、锌对蔬菜的氧化胁迫作用，改善蔬菜的生理特性[6]。目前，常用的土壤改良剂主要有含磷物质[7]、粉煤灰[8]、生物炭[9]、有机废弃物[10]和堆肥[11]等，它们能有效降低重金属在土壤中的移动性，缓解重金属对植物的毒害作用，且成本低廉。其中，堆肥是借助微生物作用将城市污泥、畜禽粪便、生活垃圾、园林绿化废弃物等有机固体废弃物进行无害化、资源化的产物[12]。堆肥主要通过吸附、沉淀、络合和氧化还原反应来固定土壤中的重金属，降低其生物有效性，减少植物对重金属的吸收，从而缓解重金属对植物的氧化胁迫[13]。此外，堆肥本身还具有较高的营养价值，可提供植物生长所需的多种营养元素[14]。受堆肥原材料固有属性的影响，有些堆肥，如污泥堆肥、畜禽粪便堆肥中重金属含量过高，应用到土壤中，可能会造成更高的污染风险[15]。相对而言，园林绿化废弃物中的重金属含量较低，它主要来源于绿地或郊区林地中绿化植物自然或养护过程中所产生的乔灌木修剪物、枯枝落叶、花园内废弃草花等，在清洁安全等方面更具优势[16]。调查显示，北京市每年产生2.37×106t的园林绿化废弃物[17]，这些废弃物给城市生态带来了巨大的压力。将园林绿化废弃物进行堆沤处理后施用于重金属污染土壤中，既能改善土壤环境，提高植物品质，又能减少废弃物的堆积[18]。

近年来，对园林绿化废弃物利用的研究，多集中在堆肥化、生产新型花木基质、生产有机覆盖物等方面[19]，而有关园林绿化废弃物堆肥(GWC)对重金属胁迫下蔬菜生理特性影响的研究较少。鉴于此，本试验以种植广泛、生长周期短的小白菜为对象，通过盆栽试验研究施用不同比例的GWC对铅、锌单一和复合污染下小白菜生物量、叶绿素、丙二醛、游离脯氨酸含量，及抗氧化酶活性的影响，探讨GWC作为改良剂促进铅、锌胁迫下小白菜生长，改善小白菜生理特性和提高其抗胁迫能力的可行性，为铅、锌污染土壤上小白菜的种植提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自北京市通州区无污染苗圃地(39°45′N，116°43′E)，取0～20 cm表层土壤，风干，去砂石和植物残体，过2 mm筛，备用。供试小白菜品种为京绿1号，购于京研益农(北京)种业科技有限公司。供试GWC由北京市某园林绿化废弃物消纳中心提供，将其风干、研磨、过2 mm筛，备用。供试土壤的基本理化性质：pH值8.02，有机质14.52 g·kg-1，全氮1.37 g·kg-1，碱解氮29.75 mg·kg-1，有效磷27.81 mg·kg-1，速效钾149.48 mg·kg-1，总铅0.58 mg·kg-1，总锌0.99 mg·kg-1。GWC的基本理化性质：pH值8.18，有机质302.62 g·kg-1，全氮17.50 g·kg-1，全磷3.20 g·kg-1，全钾6.20 g·kg-1，总铅20.82 mg·kg-1，总锌201.18 mg·kg-1。

1.2 试验设计

盆栽试验于2019年2—10月在北京林大林业科技股份有限公司的温室中进行。试验采取向供试土壤中添加外源Pb(NO3)2、Zn(NO3)2的方式来模拟铅、锌单一和复合污染土壤。

依据农用地土壤污染风险管控标准(GB 15618—2018)，对于pH>7.5的土壤，铅、锌污染的风险筛选值分别为170、300 mg·kg-1；根据2014年《全国土壤污染状况调查公报》，我国铅、锌污染以中轻度为主(300～1 000 mg·kg-1)[1]。参照上述标准，最后确定本试验的铅、锌污染水平分别为500、1 000 mg·kg-1。

将供试土壤分为3份，分别平铺在塑料薄膜上，然后分别均匀喷洒Pb(NO3)2、Zn(NO3)2溶液，并充分混合，按照设计的质量分数模拟污染土壤，保持含水率在40%～60%，培育6个月。

在铅、锌单一和复合污染土壤上分别设4个GWC施用水平(以质量分数计)：CK，0；D1，1%；D2，2%；D5，5%。共计12个处理，每个处理重复3次，共36盆。将GWC与污染土壤混合均匀，放入盆中(盆高15 cm，上直径18 cm，下直径13.5 cm，带托盘)，每盆装土1.5 kg。培养2周后播小白菜种子，当苗高超过5 cm后每盆定苗2株。试验过程中定期进行浇水、杀虫等日常管理，保持土壤湿度在田间持水量的60%，35 d后收获取样，测定小白菜生理指标。

1.3 测定项目与方法

将收获的小白菜样品先用自来水清洗干净，再用去离子水淋洗，用滤纸吸干表面水分，然后用剪刀将小白菜新鲜叶片剪碎备用。

1.3.1 生物量

采用称量法，在剪碎叶片前称取每盆小白菜的鲜重。

1.3.2 叶绿素含量

称取0.1 g剪碎的新鲜小白菜叶片，置于10 mL的丙酮-乙醇(体积比1∶1)溶液中，放在黑暗处浸提24 h，待叶片完全发白后，用UV-6100紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)测定663、645 nm处的光密度值，计算叶绿素(叶绿素a+叶绿素b)含量[20]。

1.3.3 丙二醛(MDA)含量

称取0.5 g剪碎的新鲜小白菜叶片，加5 mL 5%(质量分数)三氯乙酸溶液进行研磨提取，研磨的匀浆经过离心取上清液，采用硫代巴比妥酸法，用UV-6100紫外分光光度计测定532、600 nm处的光密度值[20]。

1.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性

称取0.5 g剪碎的新鲜小白菜叶片，加5 mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(pH值7.8)进行冰浴研磨，研磨的匀浆经过离心，取上清液即为酶提液，采用氮蓝四唑(NBT)法，以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活单位(U)，利用UV-6100紫外分光光度计测定560 nm处的光密度值[21]。

1.3.5 过氧化氢酶(CAT)活性

称取1.5 g剪碎的新鲜小白菜叶片，加5 mL 0.2 mol·L-1磷酸缓冲液(pH值7.8)进行冰浴研磨，研磨的匀浆转移定容至25 mL，经过离心取上清液即为酶提液，采用紫外吸收法，以1 min内240 nm下吸光度减少0.1的酶量为1个酶活性单位(U)，计算CAT活性[22]。

1.3.6 游离脯氨酸含量

参照李合生[21]的方法先配制脯氨酸系列标准溶液，绘制脯氨酸标准曲线，然后称取0.5 g剪碎的新鲜小白菜叶片，采用磺基水杨酸法，利用UV-6100紫外分光光度计测定520 nm处的光密度值，按照制得的标准曲线测算对应的脯氨酸含量。

1.4 数据分析

利用Microsoft Excel 2010进行数据整理和绘图，用R语言3.5.1进行完全随机设计二因子方差分析，对有显著差异(P<0.05)的，利用忠实显著性差异(Tukey’ s HSD test)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 对小白菜生物量的影响

从图1可以看出，随着GWC施用量的增加，铅、锌单一和复合污染土壤上小白菜的生物量均呈上升趋势，且均在D5处理下小白菜生物量达到最大值，分别是对照组(CK)的1.68、1.24、2.09倍。在铅单一和铅锌复合污染土壤上，D2、D5处理的小白菜生物量较CK差异显著(P<0.05)。在锌单一污染土壤上，仅有D5处理的小白菜生物量显著(P<0.05)高于CK。总体而言，GWC的施用促进了小白菜的生长。

相同污染土壤各柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05 in the same contamination soil.The same as below.图1 GWC对铅、锌污染土壤上小白菜鲜重的影响Fig.1 Effects of GWC on fresh weight of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

2.2 对小白菜叶绿素含量的影响

从图2可以看出，随着GWC施用量的增加，铅、锌单一和复合污染土壤上小白菜叶绿素含量均呈上升趋势，且均在D5处理下小白菜叶绿素含量达到最大值，分别是CK的1.35、1.28、1.19倍。在铅、锌单一污染土壤上，各处理的小白菜叶绿素含量均显著(P<0.05)高于CK。在铅锌复合污染土壤上，仅D5处理的小白菜叶绿素含量较CK差异显著(P<0.05)，其余处理较CK差异不显著。这可能是由于铅、锌的共同胁迫加剧了对小白菜叶绿素合成的影响，少量的GWC虽然能促进叶绿素的合成，但作用不显著。总体而言，GWC的施用减轻了铅、锌对叶绿素的毒害作用，提高了小白菜的叶绿素含量，且施用量越高，叶绿素含量增加越明显。

图2 GWC对铅、锌污染土壤上小白菜叶绿素含量的影响Fig.2 Effects of GWC on chlorophyll content of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

2.3 对小白菜MDA含量的影响

如图3所示：在铅单一污染土壤上，随着GWC施用量的增加，小白菜MDA含量呈下降趋势，D5处理的小白菜MDA含量较CK显著(P<0.05)下降了34.78%；在锌单一污染土壤上，各处理的小白菜MDA含量无显著差异；在铅锌复合污染土壤上，随着GWC施用量的增加，小白菜MDA含量呈下降趋势，D2、D5处理的小白菜MDA含量较CK分别显著(P<0.05)下降了25.00%、39.29%。总体而言，GWC的施用减轻了铅、锌对小白菜产生的氧化胁迫，小白菜MDA含量有不同程度的下降。

图3 GWC对铅、锌污染土壤上小白菜MDA含量的影响Fig.3 Effects of GWC on MDA content of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

2.4 对铅、锌污染土壤上小白菜SOD活性的影响

如图4所示，GWC对铅、锌单一和铅锌复合污染土壤上小白菜的SOD活性均无显著影响。

图4 GWC对铅、锌污染土壤上小白菜SOD活性的影响Fig.4 Effects of GWC on SOD activity of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

2.5 对铅、锌污染土壤上小白菜CAT活性的影响

如图5所示：在铅单一污染土壤上，D1、D2处理的小白菜CAT活性显著(P<0.05)高于CK，分别是CK的1.49、2.00倍；在锌单一污染土壤上施用GWC，小白菜CAT活性升高，且D2、D5处理的小白菜CAT活性显著(P<0.05)高于CK，分别是CK的2.14、2.06倍；在铅锌复合污染土壤上，各处理的小白菜CAT活性均显著(P<0.05)高于CK，在D2处理下达到最大值，是CK的3.77倍。总体而言，施用GWC能减轻铅、锌对小白菜CAT活性的抑制作用，提高其清除体内大量过氧化氢的能力，减轻机体遭受过氧化氢毒害的程度。

图5 GWC对铅、锌污染土壤上小白菜CAT活性的影响Fig.5 Effects of GWC on CAT activity of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

2.6 对铅、锌污染土壤上小白菜游离脯氨酸含量的影响

如图6所示：在铅单一污染土壤上，随着GWC施用量的增加，小白菜游离脯氨酸含量呈上升趋势，且D2、D5处理的小白菜游离脯氨酸含量显著(P<0.05)高于CK，并在D5处理下达到最大值，是CK的2.20倍；在锌单一污染土壤上，D2、D5处理的小白菜游离脯氨酸含量显著(P<0.05)高于CK，并于D2处理下达到最大值，是CK的1.33倍；在铅锌复合污染土壤上，随着GWC施用量的增加，小白菜游离脯氨酸含量呈上升趋势，各处理的小白菜游离脯氨酸含量均显著(P<0.05)高于CK，并在D5处理下达到最大值，是CK的2.31倍。总体而言，GWC的施用减轻了铅、锌对游离脯氨酸合成的影响，提高了小白菜体内的游离脯氨酸含量，有助于增强其抗逆性。

图6 GWC对铅、锌污染土壤上小白菜游离脯氨酸含量的影响Fig.6 Effects of GWC on free proline content of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

3 讨论

本研究表明，施用GWC有利于提高铅、锌单一和复合污染下小白菜生物量与叶绿素含量。施用GWC降低了铅、锌单一和复合污染下小白菜MDA含量，提高了铅、锌单一和复合污染下小白菜的CAT活性和游离脯氨酸含量，从而有利于保护铅、锌污染下小白菜的生长，在一定程度上增强了小白菜抵抗铅、锌胁迫的能力。

叶绿素含量与植物光合作用和氮素营养有密切的关系，在一定程度上可反映植物的生长状况和光合能力。已有研究表明，铅、锌胁迫会导致小白菜叶绿素含量降低，影响小白菜正常生长[23-24]。本研究中，施用GWC提高了铅、锌单一和复合污染土壤上小白菜的生物量与叶绿素含量(图1、2)，且随着GWC施用量的增加，小白菜生物量与叶绿素含量呈上升趋势，与Liu等[25]研究结果相似。这可能是由于不同的GWC配比造成了土壤营养的差异，从而导致小白菜生物量与叶绿素含量随着GWC施用量增加呈递增趋势[26]。王意锟等[6]研究发现，添加腐植酸能显著提高铅、锌、铜、镉复合污染土壤上菜用大豆的生物量和叶片叶绿素含量。这主要是因为腐植酸含有羧基、羟基等具有络合重金属作用的官能团，这些官能团具有刺激作物生长的作用，能促进作物叶绿素的合成。GWC中也含有大量的腐植酸，其表面所带的电荷和官能团对土壤中的铅、锌离子有较强的吸附能力[27]，能使土壤中的铅、锌发生钝化，从而减轻铅、锌对小白菜的危害。这可能是施用GWC能提高小白菜生物量与叶绿素含量的另一个原因。

在重金属胁迫下，植物细胞会产生活性氧自由基，活性氧积累会诱发膜脂过氧化。MDA是脂质氧化的终产物，MDA含量可反映膜脂过氧化的程度，以间接判断膜系统的受损程度[28]。本研究中，施用GWC不同限度地降低了铅、锌单一与复合污染土壤上小白菜的MDA含量(图3)，缓解了铅、锌对小白菜的胁迫作用。这与前人研究结果是一致的。王意锟等[29]向铅、锌、铜、镉复合污染土壤施用腐植酸显著降低了豇豆叶片的MDA含量，减轻了重金属对豇豆的氧化胁迫；李张伟等[30]使用羟基磷灰石修复铅污染土壤，使得土壤中的小白菜MDA含量显著下降，缓解了铅对小白菜的胁迫作用。腐植酸和羟基磷灰石的作用相同，都是通过吸附沉淀土壤中的重金属，减少植物对重金属的吸收，从而减轻重金属对植物叶片质膜的损伤。GWC可能也是通过自身的吸附沉淀能力降低了铅、锌的活性[31]，从而缓解了铅、锌对小白菜的氧化胁迫。

SOD与CAT是植物体内重要的抗氧化酶。SOD是活性氧自由基的消除剂，能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到重要作用[32]；CAT能催化过氧化氢分解生成氧和水，使细胞免于遭受过氧化氢的毒害[33]。本研究中，施用GWC提高了铅、锌单一和复合污染土壤上小白菜的CAT活性(图5)。有类似研究发现，纳米羟基磷灰石在一定添加范围内可提高铅污染土壤上小白菜的抗氧化酶活性[30]。王兴明等[34]研究表明，向铅、锌、铜、镉复合污染土壤上添加矸石，能显著提高香根草体内的抗氧化酶活性；王意锟等[29]研究发现，腐植酸能明显提高重金属复合污染土壤上豇豆的SOD活性。国外研究表明，施用膨胀土能使铅、镉复合污染土壤上水稻的SOD活性升高[35]。以上研究中的改良剂均通过降低土壤中重金属活性减少了植物对重金属的吸收，从而缓解重金属对植物体内抗氧化酶活性的抑制作用。GWC可能也通过降低铅、锌活性[36]，减轻铅、锌对小白菜抗氧化酶活性的抑制，提高了CAT活性，从而消除由铅、锌胁迫而产生的氧化反应。本研究中施用GWC各处理的小白菜的SOD活性较CK差异不显著(图4)，说明GWC的施入对SOD活性的影响不明显，这与Ibrahim等[37]的研究结果相似。

游离脯氨酸是植物体内一种重要的亲和性渗透调节物，在抗逆境中的主要作用是调节细胞渗透平衡和增加蛋白质的可溶性，保护生物大分子结构与稳定性和阻止氧自由基产生[38]。本研究中，施用GWC提高了铅、锌单一和复合污染土壤上小白菜的游离脯氨酸含量，且游离脯氨酸含量随着GWC施用量的增加呈上升趋势(图6)。这可能是由于GWC的施入对土壤中的铅、锌浓度有一定的稀释作用[25]，同时由于GWC能吸附一定的铅、锌[36]，从而减轻了铅、锌对小白菜游离脯氨酸合成的影响。这与王兴明等[34]的研究结果一致，而与王意锟等[29]的研究中腐植酸、泥炭对铅、锌、铜、镉复合污染土壤上豇豆脯氨酸含量的影响有差异，推测脯氨酸的变化可能与改良剂、重金属离子和植物种类有关。