转Cry抗虫基因玉米对家蚕的安全性评价

姜媛媛，纪 艺，来勇敏，陈笑芸，徐俊锋，徐晓丽，*，马莲菊

(1.农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室(筹)，浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州310021；2.沈阳师范大学 生命科学学院，辽宁 沈阳 110034)

2020年1月21日农业农村部科技教育司发布《2019年农业转基因生物安全证书(生产应用)批准清单》(http://www.moa.gov.cnztzlzjyqwgzspxx201912/t20191230_6334015.htm)，批准了2个转Bt(Bacillusthringensis)基因抗虫玉米品种获得安全证书，这标志着转基因玉米在我国的商业化种植进程迈出了重大的一步。随着转基因植物的大面积推广应用，我们在关注其所带来的巨大社会、经济和生态效益时，也需要考察其对生态环境等方面可能产生的不利影响。目前商业化种植面积较广的转Bt基因抗虫玉米的靶标害虫通常为鳞翅目害虫，而家蚕与其靶标害虫具有较近的亲缘关系，在长期驯养过程中，家蚕的抗逆性明显减弱，极易受到外界各种因素的影响。我国家蚕饲养产业在近些年由于东桑西移[1]，使主要分布在江浙一带的稻桑混种的种植模式发生了变化，养蚕业在全国的很多地区都有发展，有可能存在玉米种植区与家蚕饲养区相重叠的现象。由于玉米在散粉期向周围环境中释放大量的花粉，当表达Bt蛋白的转基因玉米花粉漂移到邻近的桑田时，有可能被家蚕取食，从而对家蚕饲养产生影响。

采用转基因植物花粉为试验材料评价其对家蚕的生态安全性目前已有许多的报道，多数研究针对转基因抗虫水稻。如王忠华等[2]评价了转cry1Ab基因水稻“克螟稻”对家蚕生长发育的影响，结果发现，无论非Bt水稻还是Bt水稻花粉处理对家蚕体重均有较大影响，但对致死率无显著影响，其采用的花粉密度为100粒·m-2，认为实际生态条件下桑叶上花粉浓度可能远远低于试验条件，因此认为稻桑共作环境下，“克螟稻”花粉对家蚕生长发育不会造成太大的影响。Yao等[3]测试了转cryAb/cryAc融合抗虫基因水稻TT9-3对家蚕的影响，结果显示，转基因水稻花粉在桑叶表面分布达3 395粒·cm-2的情况下处理蚁蚕48 h对其存活率和生长发育无显著影响，这一花粉分布密度高于稻桑共作环境下桑叶上检测到的最高花粉分布密度(1 635.9粒·cm-2)。Yang等[4]研究发现，家蚕幼虫短期(3 d)暴露于高密度的表达Cry1C或Cry2A蛋白的转基因水稻花粉对其生长发育无显著影响，但高于150粒·cm-2的全生育期暴露时，家蚕14 d体重降低，发育历期延长，成虫羽化率降低，认为自然环境下的暴露水平远低于实验条件下的暴露水平，转Bt基因水稻花粉对家蚕的风险可以忽略。Niu等[5]测试了单独表达Cry1Ac和表达Cry1Ac/Cry2Ab复合性状的棉花花粉饲喂7 d后对家蚕的影响，仅在较高密度处理组(900和8 000粒·cm-2)观测到有限的影响，认为测试的两种棉花花粉对家蚕的风险可以忽略。常雪[6]研究了3种转基因玉米N30、V3和J223(分别表达Cry1Ab/Cry2Aj、Cry1Ab/Vip3DA和Cry1Ab/Cry1I)对家蚕的影响，发现花粉浓度为40 mg·mL-1，约10 000粒·cm-2的密度涂在桑叶上时，家蚕在14 d后全部死亡。当桑叶上花粉密度为4 mg·mL-1，约1 000粒·cm-2时，对家蚕幼虫存活、茧重和茧壳重没有不利影响，但各龄眠蚕体重减轻，发育历期延长。当桑叶上的花粉密度为0.4 mg·mL-1，约100 粒·cm-2时，家蚕的生长发育不受Bt花粉的影响。

研究发现，不同的Bt蛋白对家蚕的毒性不同，Jiao等[7]检测了Cry1Fa、Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ab和Cry1Ac等5种不同的Bt蛋白对家蚕的毒性，发现对家蚕毒性最大的为Cry1Fa，而Cry1Ac的毒性最低。另外，不同品种的家蚕对同一Bt蛋白的敏感性差异也非常大，有研究发现，不同品种的家蚕对Cry1Ab的敏感性差异达25 000倍[8]。因此，家蚕也常常被用来作为研究鳞翅目昆虫对Bt毒素抗性的模式生物。Endo等[9]认为，家蚕中肠ABCC转运蛋白对Cry毒素的亲和性与其对Cry的敏感性有很大的关系。Cry1和Cry2是转基因抗虫玉米中应用最多的抗鳞翅目Bt毒素，其中Cry1Ab是应用最为广泛的，如Bt11、Bt176和MON810中均使用了Cry1Ab，我国最近新批准的2个抗虫转基因玉米新品系DBN9936和双抗12-5也均采用Cry1Ab抗虫基因。在玉米上应用的其他Cry1基因还有Cry1C、Cry1F和Cry1A.105(包含了Cry1Ab、Cry1F和Cry1Ac)，另外较常用的还有Cry2A，如MON89034中同时表达Cry2Ab2和Cry1A.105。在本研究中，我们测试了转基因玉米GAB-3花粉对家蚕的毒性，并采用饲料饲养的方法检测了6种Bt杀虫蛋白(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1B、Cry1Fa和Cry2A)对家蚕的毒性。GAB-3由浙江大学研发，目前正在申请生产性试验中，它同时表达Cry1Ab和Cry2Ab两种杀虫蛋白。前期研究发现，GAB-3各组织中杀虫蛋白表达量很高，杀虫效果很好，因此评价这一转基因玉米品系对家蚕的安全性具有代表性的意义。

1 材料与方法

1.1 供试Bt玉米花粉

转cry1Ab和cry2Ab基因玉米GAB-3种子及其对应的非转基因对照玉米种子均由浙江大学提供。2019年4月将供试玉米种子种植于浙江省农业科学院转基因植物试验基地，进行常规播种方式和栽培管理，全生育期不喷撒杀虫剂。散粉期将玉米雄穗套袋，分别收集GAB-3和非转基因对照玉米花粉，室温干燥24 h后过200目筛，移入塑料离心管中，密封后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 供试Bt蛋白

测试用Bt蛋白Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1B、Cry2Aa和Cry1Fa购自EnviroLogix Inc.(Portland，ME，USA)，将Bt蛋白溶解后并稀释为实验所需的浓度。

1.3 供试昆虫

供试家蚕品种为秋风×白玉，由浙江省农业科学院蚕桑研究所提供蚕卵，在人工气候培养箱中孵化，孵化后幼虫置于温度(27±1)℃，湿度80%±5%，光周期为16 h(L)/8 h(D)的培养箱中进行测试。

1.4 花粉蛋白检测

采用ELISA方法检测转基因玉米GAB-3花粉中杀虫蛋白含量。采用美国ENVIROLOGIX公司Cry1Ab/Cry1Ac和Cry2A检测试剂盒检测。采用酶标仪(美国伯乐680酶标仪)读板，测定450 nm处吸光值。

1.5 生物测试

1.5.1 抗虫转基因玉米GAB-3花粉对家蚕的影响

将试验用花粉配制为以下5个浓度：0、0.1、0.5、1和5 mg·mL-1，取300 μL的溶液用毛刷涂抹于直径5 cm的桑叶圆片，对应花粉分布密度为0、10、50、100和500粒·cm-2，自然晾干后，在体视显微镜下检查叶片上的实际花粉密度。每处理放置20头蚁蚕，重复3次。每天观察并记录各处理家蚕存活情况并更换叶片，毛笔轻触幼虫不能爬行则视为死亡，记录后即时清理。在试验7、14和21 d对家蚕进行称量，并记录家蚕从孵化到结茧化蛹的发育历期。结茧后，统计家蚕化蛹率、蛹重、茧重、茧壳重等指标。

1.5.2 Bt蛋白对家蚕的影响

将待测试的6种Cry蛋白分别溶解后和饲料混匀，Cry1Fa、Cry1B和 Cry1C设置浓度为：0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 μg·g-1；Cry2Aa设置浓度为：0、0.1、1、2、4和8 μg·g-1；Cry1Ab和Cry1Ac设置浓度为：0、0.1、1、10和100 μg·g-1。采用掺有不同浓度Cry蛋白的饲料饲养家蚕初孵幼虫，接入初孵蚁蚕，每天更换新鲜饲料并将剩余饲料去除干净，每个浓度梯度处理6头，重复5次。试验期间每天观察记录试虫死亡个体数，并及时移出死亡个体，试验结束后，对存活的幼虫称重并记录，计算不同Cry蛋白对家蚕的半致死剂量。

1.6 数据处理

采用Excel和SPSS 20.0对数据进行整理和分析，采用Tukey HSD对家蚕的平均体重、幼虫发育历期、茧重、茧壳重和蛹重等进行多重比较，幼虫的存活率和化蛹率进行百分数反正弦转换后再进行单因素方差分析，通过概率单位法(Probit analysis)求得GAB-3花粉和Cry蛋白对家蚕的半致死浓度。

2 结果与分析

2.1 GAB-3花粉中Cry蛋白含量

取试验用GAB-3花粉，分别检测Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量，测得转基因玉米GAB-3花粉中Cry1Ab含量为(5.54±0.80) μg·g-1，Cry2Ab蛋白为(16.87±2.19) μg·g-1。

2.2 花粉在桑叶上的分布情况检测

将制备好的桑叶放在体视镜下观察，检测花粉的分布密度，结果显示，桑叶上花粉的密度随花粉悬浊液浓度的增加而增加。采用0.1、0.5、1和5 mg·mL-1的花粉悬浊液涂抹桑叶，花粉在桑叶上的实际分布密度分别为12.5、50.52、112.16和519.12粒·cm-2，接近预期密度。

不同数据间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。The bars with different lowercase letters showed significant difference(P<0.05).图1 不同浓度花粉悬浊液处理的桑叶上花粉分布密度Fig.1 Maize pollen distribution on mulberry leaves with different pollen suspension treatment

2.3 转基因玉米花粉对家蚕生长发育的影响

2.3.1 转基因玉米花粉对家蚕幼虫存活率和体重的影响

对处理不同时间的家蚕的存活率统计分析显示，转基因玉米GAB-3花粉在桑叶上的分布密度越大，喂食的时间越长，对家蚕的存活率影响越大(表1)。与非转基因对照处理组相比，GAB-3花粉在桑叶上分布密度为10和50粒·cm-2时对家蚕21 d存活率无显著影响[ANOVA：10粒·cm-2，F=0.000，自由度(df)=1，P=1.000>0.05；50粒·cm-2，F=6.888，df=1，P=0.059>0.05]；GAB-3花粉分布密度达到100粒·cm-2时，家蚕14 d存活率显著下降为(66.67±5.77)%，但对家蚕7 d存活率无显著影响(ANOVA：7 d，F=3.623，df=1，P=0.130>0.05；14 d，F=307.954，df=1，P=0.000<0.05)。转基因玉米花粉分布密度为500粒·cm-2时，家蚕7 d存活率只有(25.00±8.66)%，14 d存活率为0，远低于对照(ANOVA：7 d，F=300.783，df=1，P<0.05；14 d，P<0.05)。

表1 不同密度花粉处理家蚕的存活率和幼虫体重Table 1 Survival rate and weight of Bombyx mori larvae fed with maize pollen of different density

对处理不同时间的家蚕的体重统计分析显示，与非转基因对照相比，以GAB-3花粉密度为10粒·cm-2的桑叶喂食家蚕7 d，对其体重无显著影响(ANOVA：F=0.938，df=1，P=0.388>0.05)，喂食14天后，其体重则显著低于对照组(ANOVA：F=22.333，df=1，P=0.009<0.05)。以GAB-3花粉密度为50粒·cm-2以上的桑叶喂食家蚕7 d，其体重显著低于对照组(ANOVA：F=127.768，df=1，P<0.05)。转基因玉米GAB-3花粉密度越高，家蚕体重的增长越少。与无花粉对照组相比，非转基因对照玉米花粉处理超过14 d对家蚕的体重也有显著影响(ANOVA：10粒·cm-2，F=46.432，df=1，P=0.002<0.05；50粒·cm-2，F=46.838，df=1，P=0.002<0.05；100粒·cm-2，F=84.687，df=1，P=0.001<0.05；500粒·cm-2，F=897.701，df=1，P<0.05)，处理时间越长，体重差异越大。

2.3.2 转基因玉米花粉对家蚕发育历期、化蛹率、茧重、茧壳重和蛹重的影响

500粒·cm-2GAB-3花粉处理组家蚕在一至二龄全部死亡，所以不统计发育历期。与无花粉对照组相比，不同浓度的转基因和非转基因花粉处理均显著延长了家蚕幼虫的发育历期，并且花粉密度越高，家蚕的发育历期越长，与相同浓度的非转基因对照花粉处理组相比，GAB-3花粉处理对家蚕发育历期有显著影响(ANOVA：10粒·cm-2，F=12.437，df=1，P=0.024<0.05；50粒·cm-2，F=27.692，df=1，P=0.006<0.05；100粒·cm-2，F=571.322，df=1，P=0.000<0.05)。100粒·cm-2以下GAB-3花粉处理组家蚕均100%化蛹，各浓度GAB-3和非转基因花粉处理组家蚕的茧重、茧壳重和蛹重均显著低于无花粉处理组，但GAB-3处理组与对应浓度的非转基因对照处理组间无显著差异(ANOVA：茧重：10粒·cm-2，F=1.453，df=1，P=0.294>0.05；50粒·cm-2，F=0.715，df=1，P=0.445>0.05；100粒·cm-2，F=0.003，df=1，P=0.959>0.05。茧壳重：10粒·cm-2，F=0.025，df=1，P=0.883>0.05；50粒·cm-2，F=3.168，df=1，P=0.150>0.05；100粒·cm-2，F=5.752，df=1，P=0.074>0.05；蛹重：10粒·cm-2，F=1.772，df=1，P=0.254>0.05；50粒·cm-2，F=1.135，df=1，P=0.347>0.05；100粒·cm-2，F=0.076，df=1，P=0.796>0.05)。

表2 不同密度花粉处理家蚕的生理指标参数表Table 2 Life table parameters of Bombyx mori larvae fed with maize pollen of different density

2.3.3 转基因玉米GAB-3花粉对家蚕的半致死浓度

根据GAB-3花粉饲喂7、14和21 d家蚕的死亡情况，计算GAB-3花粉饲喂家蚕不同时间的LC50，结果如表3所示，7 d的半致死浓度最高，为261.18粒·cm-2，14 d为122.86粒·cm-2，21 d为112.38粒·cm-2。

表3 转基因玉米GAB-3花粉对家蚕幼虫的致死效应Table 3 Lethal effect of GAB-3 pollen against Bombyx mori larvae

2.4 Cry蛋白对家蚕生长发育的影响

2.4.1 Cry蛋白对家蚕幼虫存活率的影响

分别将不同质量分数的Cry1C、Cry1Fa、Cry1B、Cry2Aa、Cry1Ab和Cry1Ac蛋白掺入饲料中测试6种Cry蛋白对家蚕的影响。结果显示，家蚕对不同的Cry蛋白敏感性有显著差异，对Cry1Ac和Cry1Ab最不敏感，饲料中掺入高达100 μg·g-1的Cry1Ac蛋白对家蚕的7 d存活率无显著影响，其次为Cry1Ab，质量分数达100 μg·g-1时，家蚕7 d存活率仍接近80%；毒性最强的是Cry1C和Cry1Fa，饲料中掺入质量分数达0.8 μg·g-1时，家蚕即全部死亡，Cry1B和Cry2Aa的毒性中等，Cry1B质量分数为1.6 μg·g-1时，家蚕全部死亡，Cry2Aa质量分数达4 μg·g-1时，家蚕的存活率降到23.33%(图2)。

图2 六种Cry蛋白对家蚕幼虫存活率的影响Fig.2 Survival rate of neonate larvae exposed to Cry1C，Cry1Fa，Cry1B，Cry2Aa，Cry1Ab and Cry1Ac for 7 days

2.4.2 Cry蛋白对家蚕体重的影响

家蚕取食几种Cry蛋白后体重多明显下降，且处理浓度越高，下降越为明显(ANOVA：Cry1C，F=74.194；df=6；P<0.05；Cry1Fa，F=57.721；df=6；P<0.05；Cry1B，F=30.702；df=6；P<0.05；Cry2Aa，F=115.948；df=5；P<0.05；Cry1Ab，F=34.430；df=4；P<0.05；Cry1Ac：，F=56.913；df=4；P<0.05)。Cry1C、Cry1Fa和Cry1B蛋白达到一定浓度时，对家蚕有较为明显的致死效应，在较低浓度时对家蚕体重也有显著的影响，当饲料中Cry1C浓度达0.05 μg·g-1，Cry1Fa浓度达0.1 μg·g-1，Cry1B浓度达0.8 μg·g-1时即对家蚕的体重有显著的影响；Cry2Aa浓度达1 μg·g-1时对家蚕体重有显著的影响，Cry1Ab在达10 μg·g-1时，Cry1Ac在达1 μg·g-1时对家蚕体重有显著影响(表4)。

表4 饲喂家蚕幼虫Cry蛋白7 d体重Table 4 The weight of larvae exposed to Cry1C，Cry1Fa，Cry1B，Cry1Ab，Cry1Ac and Cry2Aa for 7 days

2.4.3 Cry蛋白对家蚕幼虫的半致死效应

6种Cry蛋白对家蚕的7 d半致死浓度见表5。结果显示，家蚕对Cry1C和Cry1Fa最为敏感，LC50均为0.39 μg·g-1，Cry1B的LC50为1.04 μg·g-1，Cry2Aa的LC50为2.89 μg·g-1。Cry1Ab的LC50为6 333.99 μg·g-1，Cry1Ac各试验浓度间死亡率无显著差异，未获得半致死剂量。家蚕对6种Bt蛋白的敏感程度为Cry1C>Cry1Fa>Cry1B>Cry2Aa>Cry1Ab>Cry1Ac。

表5 Cry蛋白对家蚕幼虫的半致死效应Table 5 Lethal effect of 6 Cry proteins against Bombyx mori larvae

3 讨论

在转基因植物表达的外源杀虫蛋白对非靶标生物的环境安全评价相关试验中，受试杀虫蛋白剂量的选择通常要考察自然条件下的暴露量。家蚕接触杀虫蛋白的途径主要通过转基因植物花粉漂移到桑叶的途径，因此桑叶上花粉的分布密度是评价转基因抗虫植物对家蚕可能造成的影响首先考虑的要素。受气候条件、地形等各种因素的影响，花粉漂移的距离有很大的差异。对紧邻稻田的桑树上水稻花粉的分布数量调查结果显示，10 m范围内桑叶上花粉平均分布密度为92.9粒·cm-2[10]。与水稻相比，玉米花粉大而且重，在一般的气象条件下，大部分的玉米花粉会沉积在20～40 m的范围内[11]。目前没有玉米花粉在桑叶上的沉积数量的调查，但关于玉米花粉在荨麻上的沉积数量调查显示，紧邻玉米地时花粉密度达100粒·cm-2，超过10 m时下降到10粒·cm-2以下[12]。Bt玉米花粉向马利筋叶片(Asclepiassyriaca)上自然飘落的调查结果显示，距离玉米地边缘为2 m时，花粉密度降到14.2粒·cm-2[13]。与荨麻和马利筋相比，桑树更高，桑叶表面也更光滑，前排的树木会形成遮挡，阻止花粉向后排树上漂移，并且在饲喂幼蚕时采集的桑叶为位于顶端的幼嫩桑叶，有时需要清洗消毒，这些都会大大降低家蚕平均摄取到的花粉数量。抗虫蛋白在转基因植物花粉中的表达水平是另一个影响暴露量的因素。不同的转化体由于采用的启动子不同或遗传背景等方面的差异，其外源蛋白的表达水平在不同组织和器官间存在很大的差异，如转基因玉米MON810花粉中Cry1Ab的含量为Bt176的1/40[6]。Yao等[14]报道家蚕对Bt水稻B1(Cry1Ab)和KMD1(Cry1Ab)的花粉敏感，对TT9-3(Cry1Ab/Cry1Ac)不敏感，认为其中一个重要原因是花粉中蛋白表达量的差异。GAB-3中Cry1Ab和Cry2Ab基因采用的启动子分别为ZmUbi-1和Actin-1，Bt蛋白在各组织中均有表达，我们检测发现Cry1Ab和Cry2Ab在花粉中的表达量分别达到了(5.54±0.80) μg·g-1和(16.87±2.19)μg·g-1，Cry1Ab的表达水平接近Bt176(1.1～5.0 μg·g-1)，远高于MON810(<0.09 μg·g-1)[6]。

暴露时间的选择是评价转抗虫基因植物对非靶标生物影响的另一个要素。本试验发现，转基因玉米花粉密度为10和50粒·cm-2时对家蚕21 d存活率无显著影响，100粒·cm-2的处理对家蚕7 d的存活率无显著影响，14 d的半致死剂量不到7 d的一半，这显示评价转基因玉米对家蚕的安全性试验中接触时间的长短有很大的影响，短时间高剂量的暴露并不会对家蚕产生较大的影响，在转基因水稻上也有类似报道[3-4]。玉米散粉盛期为不到一周的时间，即使刚好在这段时间饲养幼蚕，其接触花粉的时间一般不会超过1周，因此1周或更短的暴露时间更能反映真实的情况。本试验结果表明，与对照组相比，高于50粒·cm-2GAB-3的花粉处理对家蚕的体重有显著影响，但是与非转基因对照花粉处理组相比，GAB-3花粉处理组的茧重、茧壳重和蛹重并无显著差异。同时发现非转基因玉米的花粉对家蚕的发育历期和体重也有显著的影响，这可能是由于当桑叶表面附有花粉时，家蚕会出现进食下降，从而造成同时期取食有花粉桑叶的家蚕体重低于无花粉对照组。

转基因玉米中表达的Bt蛋白类型对家蚕的安全性有显著的影响。本试验显示，家蚕对不同的Bt蛋白敏感性差异非常大，其中Cry1Ab是转基因抗虫玉米中使用最广泛的Bt蛋白，家蚕对其敏感性较低，这可能也是许多表达Cry1Ab或Cry1Ac蛋白的转基因植物花粉对家蚕生长发育无显著影响的原因[2-3，5]。Cry1B和Cry2A在测试的6种Bt蛋白中对家蚕的毒性中等，Cry1B在目前商业化的转基因玉米中未见使用，Cry1C和Cry1Fa对家蚕毒性最高，二者也均有在转基因玉米中获得应用，表达这2种杀虫蛋白的转基因玉米花粉可能会对家蚕有较高的毒性，但要结合蛋白在花粉中的表达水平进行判断。目前我国接近商业化的转基因玉米中采用的Bt杀虫蛋白主要为Cry1Ab，其对家蚕的毒性较低。GAB-3中同时表达低毒性的Cry1Ab和中毒性的Cry2A两种杀虫蛋白，一定程度上增加了其花粉对家蚕的毒性，但短时间较低密度花粉的暴露对家蚕的存活和生长发育未造成显著影响。在实际生产中，家蚕接触到的转基因玉米花粉密度较低，暴露时间也比较短。因此，认为转Cry抗虫基因玉米对家蚕的风险较低。