套作模式下玉米荫蔽对大豆叶片叶绿体结构及光合特性的影响

谭婷婷 范元芳 李盛蓝 王仲林 杨 峰 杨文钰

(四川农业大学农学院/农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室/四川省作物带状复合种植工程技术研究中心，四川 成都 611130)

大豆是我国重要的植物油和植物蛋白来源[1]，随着生活水平提升，人们对大豆的需求量日渐增加[2]。近十年来，我国大豆进口量远高于出口量[3]，2018年我国大豆进口量约8 800万 t[4]，但大豆年产量仅约为1 300 万 t[5]，进口依存度大。间套作种植是农业生产集约化、提高土地当量比的重要农艺措施[6-7]，玉米大豆间套作是禾本科和豆科间套作模式之一[8]。玉米大豆带状套作是西南地区主推的种植模式，可在增加大豆种植面积的同时不影响玉米产量，对保障区域和国家粮食安全起到了重要作用[9-11]。在玉米大豆带状套作种植中，大豆营养生长期易受到玉米荫蔽而导致后期产量显著降低[12]，而提升光合作用是提高大豆产量的生理基础[13]。

叶片光合作用过程中叶绿体负责光能的吸收、传递、转化和电子传递等[14-16]，而叶片和叶绿体的结构特征直接影响植物的光合能力[17-18]。在玉米大豆带状套作系统下，大豆叶片的叶面积、叶绿素含量和非光化学荧光猝灭系数(non-photochemical quenching，NPQ)增加[19-20]，而叶片碳氮比、叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度和叶片光系统Ⅱ的潜在活性(potential activity of PSⅡ，Fv/Fo)降低[21-22]。前人主要围绕大豆农艺性状、叶绿素含量、叶绿素荧光参数和叶肉组织结构进行研究，对荫蔽下大豆叶片栅栏组织内叶绿体结构变化的研究较少，且前人研究多围绕叶绿体大小、基粒数量、淀粉粒大小等指标，而探讨不同品种叶片叶绿体结构和光合荧光对不同荫蔽程度响应的较少[23-25]。因此，本研究在前人研究基础上，深入分析了不同品种叶片叶绿体结构特征、基粒面积以及淀粉粒面积和叶绿体面积的比例关系对荫蔽的响应，揭示不同品种叶片结构特征与光合荧光特性对不同荫蔽程度的响应差异，旨在为耐荫性大豆品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试玉米(ZeamaysL.)品种选用川单418(春播生育期109 d左右[26]，株型半紧凑，由四川农业大学玉米研究所提供)；供试大豆[Glycinemaxl(L.) Merr]品种选用南豆12(四川省主推品种[27]，光不敏感型[28]，夏播生育期127 d左右[29]，株型收敛，由四川农业大学农学院提供)和桂夏3号(适合玉米套作[30]，光敏感型[31]，夏播生育期115 d左右[32]，株型收敛，由四川农业大学农学院提供)。

1.2 试验设计

试验于2018年在四川农业大学成都校区进行，采用盆栽试验，模拟大田玉米大豆套作种植，供试土壤为有机质与大田土(紫色土，pH值6.99，有机质含量1.19%)按2∶1比例混合。大豆设置3个处理：大豆单作(CK)，单行玉米间套作大豆(A1；玉米行距100 cm，大豆放置在玉米行间，大豆行与玉米行间距为50 cm)和两行玉米带间套作大豆(A2；玉米窄行40 cm，宽行160 cm，两行大豆放置在玉米宽行内，大豆行与玉米行间距为70 cm)。玉米于3月18日育苗，4月1日移栽，定植于直径30 cm、高25 cm的花盆中，每盆1株，每行12盆，8月3日收获。大豆于5月25日播种于长50 cm、宽20 cm、高15 cm的花盆中，每盆1行4株，株距10 cm，每个处理种植10盆。期间对盆栽玉米大豆进行科学的水肥管理。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 大豆冠层光量子通量密度 于大豆V5时期(大豆第5片复叶全展，玉米进入灌浆期)，在晴天9:00-17:00每间隔2 h对大豆冠层光量子通量密度(photosynthetic photon flux density，PPFD)的日变化进行测定。测定时，将HR-350手持式光谱计(中国台湾Hi-Point公司)放在大豆冠层顶部上方10 cm处，由西向东依次测定5个点[33]，取平均值作为大豆冠层的光环境数据。

1.3.2 大豆叶片光合参数 于大豆V5时期，采用Li-6400XT光合仪(美国Li-Cor公司)在晴天11:00测定大豆叶片的净光合速率(net photosynthesis rate，Pn)、蒸腾速率(transpiration rate，Tr)、气孔导度(stomatal conductance，Gs)、胞间CO2浓度(intercellular CO2concentration，Ci)。设定PPFD恒定为1 000 μmol·m-2·s-1，CO2浓度为450 μmol·mol-1，温度为25℃[34]。测定时，选择大豆植株倒三复叶(从上往下数第3片全展复叶)的中间叶片进行测定。各处理选择3株具有代表性的大豆植株进行测定，取平均值。

1.3.3 大豆叶片叶绿素荧光参数 于大豆V5时期，采用CF Image叶绿素荧光成像系统(英国Technologica公司)测定大豆叶片PSⅡ的潜在活性(Fv/Fo)、PSⅡ原初光能转化效率(maximal PSⅡ quantum yield in the dark，Fv/Fm)、非光化学荧光猝灭系数(NPQ)、PSⅡ有效光化学量子产量(photochemical efficiency of PSⅡ in the light，Fv′/Fm′)、PSⅡ实际光化学效率(actual light quantum yield of PSⅡ，F′q/F′m)。

Fv/Fo=(Fm-Fo)/Fo

(1)

式中，Fm指最大荧光，Fo指最小初始荧光。各处理选择3株具有代表性的大豆植株进行测定，取平均值。

1.3.4 大豆叶片叶绿体超微结构 于大豆V5时期，在大豆倒三复叶中间叶片靠近主叶脉基部的1/3处取样(0.5 cm×1 cm)，先用3%戊二醛进行预固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，再用Epon812环氧树脂(美国Sigma公司)包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，然后用醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，最后用H-600IV型透射电镜(日本Hitachi公司)观察拍照[36]。各处理选择3株具有代表性的大豆植株，采用Image J软件测定叶绿体内基粒数量、叶绿体内基粒厚度、基粒面积、淀粉粒面积和叶绿体面积。

1.3.5 大豆叶片解剖结构 于大豆V5时期，选取倒三复叶的中间叶片，在靠近主脉基部的1/3处取样(0.5 cm×0.5 cm)。将剪下的材料快速放入标准固定液(formaldehyde-acetic acid-ethanol fixative，FAA)中固定保存，先用酒精和正丁醇系列脱水，石蜡包埋，随后用Leica切片机(德国Leica公司)切片，然后使用松节油和酒精系列脱蜡、复水后进行番红-固绿染色，最后用中性树胶封片，做成石蜡切片。用Nikon eclipse 50i显微镜(日本Nikon公司)观察并拍照[37]，用Image J软件测量大豆叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度等参数。各处理选择3株具有代表性的大豆植株进行分析。

1.4 数据处理分析

采用Origin Pro 2018软件作图，SPSS 18.0软件进行数据统计与分析，对试验结果进行单因素方差分析，并采用SSR法(shortest significant ranges)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 大豆冠层光量子通量密度

由图1可知，3个处理下两品种大豆冠层PPFD在一天内均呈先增加后降低的变化趋势。A1、A2的PPFD显著低于CK，其中，A1、A2在13:00的PPFD分别较CK显著降低82.99%和72.64%。这些结果与套作大豆行与玉米行之间的距离(A1和A2的玉米行和大豆行间距分别为50和70 cm)及玉米的行距(A1的玉米行距为100 cm，A2的玉米宽行行距为160 cm)有关。

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level among treatments.图1 不同处理下大豆冠层PPFDFig.1 Soybean canopy photosynthetic photon flux density under different treatments

表1 玉米荫蔽对大豆叶片光合参数的影响Table 1 Effects of maize shading on photosynthetic parameters of soybean leaves

2.2 大豆叶片光合参数

由表1可知，荫蔽下大豆叶片Pn、Gs、Tr显著低于CK，但3个处理的Ci差异不显著。在A1和A2条件下，两品种大豆叶片Pn、Gs、Tr平均较CK分别降低44.32%和39.00%(A1和A2，下同)、43.33%和31.11%、42.46%和10.22%。同时，除桂夏3号的Pn外，两大豆品种在A2的Pn、Gs、Tr显著高于A1，且相同处理条件下，南豆12的Pn和Gs高于桂夏3号。

2.3 大豆叶片叶绿素荧光

由表2可知，荫蔽下大豆叶片的Fv/Fo和Fv/Fm显著高于CK，Fq′/Fm′显著低于CK，但3个处理的NPQ和Fv′/Fm′差异不显著。两品种在A1和A2的叶片Fv/Fo和Fv/Fm平均较CK增加24.96%和22.34%、4.52%和3.87%，Fq′/Fm′平均较CK降低8.93%和16.07%。此外，除桂夏3号在A1的Fq′/Fm′显著高于A2外，两品种在A1的Fv/Fo、Fv/Fm和Fq′/Fm′与A2差异均不显著。相同处理条件下，南豆12叶片的Fv/Fo、Fv/Fm和Fq′/Fm′均高于桂夏3号。

2.4 大豆叶片解剖结构

由图2和表3可知，与CK相比，荫蔽下大豆叶片厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚度降低，海绵组织和栅栏组织排列稀疏。南豆12在A1和A2的叶片厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度较CK分别显著降低38.09%和21.36%、45.24%和30.94%、54.04%和44.89%，桂夏3号在A1和A2的叶片厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度较CK分别显著降低48.15%和32.04%、51.12%和38.75%、63.58%和58.79%。南豆12和桂夏3号在A1的上表皮厚度分别较CK显著降低12.60%和14.39%，但南豆12和桂夏3号在A2的上表皮厚度与CK差异不显著。此外，桂夏3号在A1的海绵组织厚度较CK显著降低47.41%，但A2的海绵组织厚度与CK差异不显著；南豆12在3个处理的海绵组织厚度差异均不显著。两大豆品种在A2的叶片厚度和下表皮厚度显著高于A1。玉米荫蔽下，南豆12的叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚度均高于相同处理的桂夏3号。

表2 玉米荫蔽对大豆叶片叶绿素荧光参数的影响Table 2 Effects of maize shading on chlorophyll fluorescence parameters of soybean leaves

注：A、B、C分别为南豆12在A1、A2、CK的叶片解剖结构图，D、E、F分别为桂夏3号在A1、A2、CK的叶片解剖结构图。Note: A, B, and C are the leaf anatomical structure of Nandou 12 under A1, A2, and CK, respectively. D, E, and F are the leaf anatomical structure of Guixia 3 under A1, A2, and CK, respectively.图2 玉米荫蔽对大豆叶片解剖结构的影响Fig.2 Effects of maize shading on anatomical structure of soybean leaves

2.5 大豆叶片叶绿体超微结构

由图3和表4可知，荫蔽下，两大豆品种叶绿体基粒厚度和基粒面积/叶绿体面积较CK显著增加；桂夏3号淀粉粒面积和淀粉粒面积/叶绿体面积较CK显著增加，南豆12在A1的淀粉粒面积和淀粉粒面积/叶绿体面积较CK显著增加，但A2的淀粉粒面积和淀粉粒面积/叶绿体面积与CK差异不显著；两大豆品种基粒数量变化规律不同，荫蔽下南豆12的基粒数量较CK增加，桂夏3号则较CK降低。此外，两大豆品种在A1的基粒厚度、基粒面积/叶绿体面积、淀粉粒淀粉粒面积/叶绿体面积均显著高于A2，且南豆12的基粒厚度、淀粉粒面积和淀粉粒面积/叶绿体面积均高于桂夏3号。

3 讨论

光照强度影响大豆的生长发育[22]。本研究中套作条件下玉米荫蔽导致大豆冠层PPFD显著降低，同时导致大豆叶片Pn、Gs和Tr显著降低，这与程亚娇等[38]使用遮阴网设置不同光强分析大豆光合特性的研究结果相似。许大全[39]研究表明，若叶片Pn降低的主要因素是气孔部分关闭，则Ci降低；若Pn降低的主要因素是叶肉细胞光合活性降低，则Ci升高。在本研究中，随着玉米荫蔽程度增加，大豆叶片Pn、Gs和Tr降低，而Ci略有增加但差异不显著，说明荫蔽下大豆叶片Pn下降的主要因素不是气孔限制。

表3 玉米荫蔽对大豆叶片解剖结构的影响Table 3 Effects of maize shading on anatomical structure of soybean leaves /μm

叶绿素荧光能反映环境因子对植物光合作用的影响[40]。在本研究中，玉米荫蔽下大豆叶片Fv/Fo和Fv/Fm较CK显著增加，但F′q/F′m显著降低，与范元芳等[41]关于荫蔽环境下大豆叶片F′v/F′m和F′q/F′m增加，Fv/Fm和NPQ下降的研究结果不一致。荫蔽导致大豆冠层PPFD降低，捕光复合体Ⅱ(light harvesting complex Ⅱ，LHCⅡ)捕获的光能降低，进而使PSⅡ可利用的光能降低。以上变化可能使电子载体质体醌(plastoquinones，PQ)还原减少，导致PSⅡ至细胞色素b6f复合体(cytochrome b6f)的电子传递效率降低，而电子传递又推动一系列光合反应，因此大豆叶片实际光效率降低。但大豆叶片捕获的光能降低，可能促使F′v/F′o和Fv/Fm增加，光能利用潜力增加。荫蔽环境下南豆12叶片的Fv/Fo、Fv/Fm及Fq′/Fm′高于桂夏3号，NPQ低于桂夏3号，说明南豆12捕获的光能用于光化学反应的比例更高，能够更好地通过增强光能捕获效率来弥补弱光对自身发育的影响。

植物能通过调节光合器官的结构来适应不同光环境[42]。叶片作为光合作用的主要器官，荫蔽环境下其形态结构会发生改变[43-44]。本研究中，荫蔽下大豆叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度均降低，栅栏组织和海绵组织排列稀疏。叶片厚度和栅栏组织厚度与叶片光合能力密切相关[45-47]，荫蔽下南豆12的叶片厚度和栅栏组织厚度高于桂夏3号，说明南豆12在荫蔽环境下栅栏组织更发达，有较好的叶片结构来容纳更多的叶绿体，降低荫蔽对自身光合作用的影响。

叶绿体是高等植物进行光合作用的场所，大豆叶片光合速率的改变必然与叶绿体紧密相关[48]。本研究中，荫蔽导致大豆叶片叶绿体长边背向细胞壁凸起，变为不规则的椭圆形状，叶绿体基粒厚度和基粒面积/叶绿体面积增加，说明大豆受荫蔽胁迫后，叶绿体可能通过增加类囊体垛叠程度来增加光合膜面积，增加光合反应场所，提高光能捕获能力，促进光能吸收传递、电子传递和ATP的产生。此外，玉米荫蔽下可使叶绿体内淀粉粒面积较CK显著增加，这可能是因为荫蔽使淀粉运输受阻，以淀粉粒形式储存在叶绿体内，导致淀粉粒面积增加，其具体机理还需通过试验进一步研究。荫蔽环境下大豆叶片叶绿体基粒数量变化在品种间表现不一致，南豆12的基粒数量较CK增加，桂夏3号则降低，且南豆12叶绿体的基粒厚度、淀粉粒面积及淀粉粒面积/叶绿体面积均高于桂夏3号，说明与桂夏3号相比，套作玉米荫蔽下南豆12的类囊体垛叠程度和基粒总面积更高，捕光结构更加密集，淀粉积累量更多，制造光合产物的能力更强。盆栽种植条件下，花盆将玉米和大豆的根系分隔开，不存在养分与水分等的竞争[49]，这与大田种植存在一定的差异，故下步试验将探讨大田种植下，玉米荫蔽对大豆叶片的影响。

4 结论

套作玉米荫蔽下大豆叶片叶绿体基粒垛叠程度增加，叶肉组织排列稀疏，Pn和F′q/F′m下降，随着荫蔽程度增加，大豆叶片叶绿体基粒厚度、基粒面积/叶绿体面积、淀粉粒面积和Fv/Fm增加，叶片厚度、栅栏组织厚度、Pn、Gs和Tr降低。荫蔽下，南豆12的叶片叶绿体基粒厚度、基粒面积/叶绿体面积、栅栏组织厚度、Pn等均高于桂夏3号，说明与桂夏3号相比，荫蔽环境下南豆12具有较好的叶绿体结构和叶片结构来提高捕光能力。