幽门螺杆菌感染的胃癌和癌前病变组织中肿瘤坏死因子-α的表达及临床意义

郑轶 刘颜敏 陈志涛 裴昕屿 龚旭阳 张姮

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康[1]。2018年全球癌症统计数据显示，胃癌死亡率仍高居全球癌症死亡率的第三位[2]。我国约90%胃癌患者确诊时已处于中晚期，其治疗效果差、费用高。因此，寻找胃癌病因并降低其发病率、死亡率是亟待解决的重要问题。早在1994年WHO国际癌症研究机构即将HP定义为Ⅰ类致癌因子，近年来多项共识意见提及HP感染与胃癌发生和预防的关系[3-4]。流行病学统计数据显示，在全球范围内，约90%非贲门胃癌与HP感染相关[5]。HP感染通过其产生的毒力因素诱导机体产生炎性反应，可引起T细胞浸润和激活单核巨噬细胞，还可使胃黏膜中多种炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α产生过多，而这些细胞因子在肿瘤的发生过程中可能具有重要作用[6]。TNF-α是由单核-吞噬细胞分泌的一种单核因子，最初被认为具有抗肿瘤作用，但目前的研究发现TNF-α对肿瘤的发生、发展具有促进作用。有研究结果显示，TNF-α不仅可以启动凋亡信号，还可以激活抗凋亡因子核因子(NF)-κB，促进细胞增殖、抑制凋亡，从而导致肿瘤发生，在慢性胃炎进展至胃癌的过程中起重要作用[7]。本研究通过检测TNF-α在HP阳性的慢性浅表性胃炎、癌前病变及胃癌组织中的表达，探讨TNF-α在胃癌发生过程中的作用及临床意义，为胃癌的早期诊断和治疗提供依据。

材料与方法

1.材料：收集2017年1月～2019年6月就诊于我院的HP阳性[HP(+)]患者胃黏膜活检标本400例，其中HP(+)慢性浅表性胃炎组200例、HP(+)癌前病变组120例、HP(+)胃癌组80例，病理诊断标准参照《慢性胃炎及上皮性肿瘤胃黏膜活检病理诊断共识》[8]。收集同期HP阴性[HP(-)]患者胃黏膜活检标本110例，其中HP(-)慢性浅表性胃炎组60例、HP(-)癌前病变组25例、HP(-)胃癌组25例。本研究经我院伦理委员会审批通过。

2.方法

(1)实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定TNF-α mRNA：使用Trizol(Invitrogen 公司)裂解新鲜胃黏膜组织标本，0.2 ml氯仿抽提，以12 000 r/min离心2 min，70%乙醇洗涤，焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，而后使用分光光度计(Bio-Rad 公司)测定TNF-α的总RNA含量和纯度。cDNA合成及PCR扩增具体步骤均参照TaKaRa试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]说明书进行，以GAPDH作为内参，引物序列和反应条件见表1。PCR反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，40个循环。所得实验数据采用相对定量2-△△Ct法进行结果分析，比较目的基因在不同样本中的差异，每个样本均重复检测3次，取平均值。

表1 引物序列

(2)蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测TNF-α蛋白：提取胃黏膜组织蛋白后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据目的蛋白分子量大小切割凝胶，以200 mA的电流冰上转膜90 min，电转结束后，采用5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭2 h。将转膜封闭后的条带放入配置好的一抗稀释液(1∶1 000，武汉博士德生物工程有限公司)中，置于4 ℃冰箱孵育过夜，TBST(三缓冲生理盐水-吐温20)缓冲液共洗涤3次，每次10 min。配置合适的二抗稀释液(1∶5 000，武汉博士德生物工程有限公司)，室温孵育1 h，然后用TBST缓冲液共洗涤3次，每次5 min，在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Solarbio公司)上加入化学发光液。采用ImageQuant LAS 4000mini凝胶成像仪对PVDF膜进行显影。

结 果

1.TNF-α mRNA和TNF-α蛋白在HP(+)胃黏膜组织中的表达比较：TNF-α mRNA和TNF-α蛋白在HP(+)慢性浅表性胃炎组、HP(+)癌前病变组和HP(+)胃癌组中均有表达，且表达水平在3组中均依次升高，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.TNF-α mRNA和TNF-α蛋白在同类型HP(+)组和HP(-)组胃黏膜组织中的表达比较：与HP(-)组比较，各组织类型HP(+)组的TNF-α mRNA和TNF-α蛋白表达明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 TNF-α mRNA和TNF-α蛋白在HP(+)、HP(-)胃黏膜组织中的表达比较

讨 论

全球范围内约有50%的人口存在HP感染，HP感染与慢性胃炎、胃溃疡、胃癌等胃部疾病的发生密切相关[9-10]。早在1994年，世界卫生组织将HP纳入Ⅰ类致癌物，可介导正常胃黏膜向萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生(又称上皮内瘤变)、胃癌转变，其感染可诱发胃癌发生[11]。HP可诱导胃黏膜产生TNF-α，抑制胃酸分泌，有利于HP定植，最终导致多种胃黏膜病变[12]。Lee等[13]对48 064例HP感染患者进行研究，发现根除HP能够有效降低胃癌的发生风险(IRR=0.53，95%CI0.44～0.64)。

TNF-α本身具有细胞毒作用，可激活T淋巴细胞和B淋巴细胞，增加自然杀伤细胞的杀伤能力，可介导多种生物学作用如诱导凋亡、促进原癌基因表达等，直接或间接引起细胞损伤，在HP感染患者中具有重要作用。袁淑芳等[14]研究表明，HP感染程度越严重，胃黏膜组织中TNF-α水平越高，HP根除后血清和胃黏膜组织中的TNF-α水平明显下降，与根除前比较差异有统计学意义，提示TNF-α与HP感染相关，且参与了胃黏膜损伤的病理过程。国外研究报道，胃癌患者血清中TNF-α水平明显高于胃部良性疾病患者及正常人群，手术切除胃癌后患者血清TNF-α水平明显下降，但术后复发或转移者血清TNF-α水平又再度升高，提示TNF-α与胃癌的发生有关且对其有促进作用[15]。

本研究通过研究HP感染的慢性胃炎进展至胃癌过程中TNF-α的表达，探讨TNF-α表达与HP感染和疾病严重程度的关系，结果显示，TNF-α在慢性浅表性胃炎进展至胃癌过程中表达水平逐渐升高，差异有统计学意义。此外，HP(+)胃黏膜组织中TNF-α的表达水平明显高于HP(-)同类型胃黏膜组织，与既往研究结果一致[14]。

综上所述，TNF-α异常表达可能是HP促进胃癌发生的机制之一，胃黏膜病变程度越重，TNF-α表达水平越高，为临床通过根除HP感染来预防胃癌的发生提供了一定的理论基础。