新型冠状病毒SARS-CoV-2的病原学特征及检测技术研究进展

2020-12-01 07:24陈新鹏董昌金李文静涂俊铭
关键词:核酸研究者基因组

陈新鹏,董昌金,李文静,涂俊铭,夏 险

(1.食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室,生物学国家级实验教学示范中心,湖北师范大学生命科学学院;2.湖北师范大学创新创业学院,湖北 黄石 435002)

0 引言

冠状病毒(Coronavirus)是一种有包膜、核衣壳和单条正链RNA组成病毒[1, 2]。该病毒可感染哺乳动物或者鸟类的呼吸系统,从而引发疾病。最早发现的人类冠状病毒是HCoV-229E(1966年)和HCoV-OC43(1967年)[1]。科学家们陆续发现了严重呼吸道感染病毒SARS-CoV(2003年)、HCoV-NL63(2004年)、HcoV-HKU1(2005年)和中东呼吸道严重感染病毒 MERS-CoV(2012年)[2]。HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HcoV-HKU1四种冠状病毒通常只会引起普通感冒症状[3],而SARS-CoV和MERS-CoV则会导致严重呼吸道疾病甚至死亡[4]。冠状病毒基因组包括5’非翻译区(5’UTR),复制酶复合体(orf1ab),刺突S 基因,小包膜E基因,包膜糖蛋白M基因,核衣壳N基因,3’非翻译区(3’UTR)和几个未知功能的开放阅读框组成。

2019年12月初爆发的新型冠状病毒肺炎,病原体为不同于SARS-CoV和MERS-CoV的严重性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。其在电子显微镜下的形态如图1所示(http://www.nmdc.cn/nCoV)。自爆发以来,该病毒受到中国政府乃至世界各国和世界卫生组织的高度重视。本文对SARS-CoV-2的发现、病原学特征及检测技术研究进展等方面进行了综述。

图1 SARS-CoV-2电镜图(新型冠状病毒国家科技资源服务系统)

1 病毒的发现

2019年12月初,武汉陆续出现与华南海鲜批发市场相关的肺炎患者,起初被认为与SARS相关,引起湖北省武汉市和国家疾病控制中心的注意;2020年1月1日,华南海鲜批发市场被关闭;2020年1月6日,国家疾病控制中心正式启动二级响应机制;2020年1月7日,中国疾病控制中心发布此次疫情的爆发由一种新型的冠状病毒SARS-CoV-2引起,不同于MERS-CoV 和SARS-CoV;2020年1月10日,SARS-CoV-2 的全基因组公布;2020年1月12日,世界卫生组织(WHO)正式将这种新型冠状病毒命名为2019-nCoV;2020年1月13日,首次在境外(泰国)检测到SARS-CoV-2的感染患者;2020年1月15日,国家疾病控制中心启动一级响应机制(最高级别);2020年1月24日,有报道从患者组织样品中分离和鉴定了SARS-CoV-2病毒颗粒,并对该病毒进行了表征[5]。2020年1月30日,WHO认定此次疫情为“国际关注的突发公共卫生事件”。2020年2月11日国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组将2019-nCoV正式命名为严重性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。随着病毒的扩散,疫情逐渐在全世界蔓延开来。

2 病毒的分类地位

冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae),其得名来自于表面的病毒粒子像王冠(拉丁文即corona)[6]。根据系统发育分析,冠状病毒主要分为α、β、γ和δ四个属[7],此前报道的人类冠状病毒分布在α-冠状病毒属(HCoV-229E、HCoV-NL63)、β-冠状病毒属(HCoV-OC43、HcoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV)两大类中[1]。SARS-CoV-2与β-冠状病毒属的复制酶保守结构域相似度接近90%,而且系统进化分析和β-冠状病毒属特异性基因的扩增结果也表明SARS-CoV-2属于β-冠状病毒属(图2)[8,9]。

图2 SARS-CoV-2的进化分析[9]

3 溯源与进化

全基因组公布后,研究者对SARS-CoV-2进行了溯源分析。基于全基因组的进化序列分析表明,SARS-CoV-2与来自蝙蝠的SARS-CoV-like冠状病毒位于同一分支[8]。利用Beta冠状病毒基因组中的一个互补回文序列(Nankai complemented palindrome)和其所在的编码区(Nankai CDS)进行的溯源分析表明SARS-CoV-2可能源自中华菊头蝠[10]。但是,也有报道基于不同动物物种之间的相对同义密码子使用偏爱(SCUB)情况进行分析,结果认为蛇可能是SARS-CoV-2病毒的来源[11]。另外,也有研究者通过比较所有宿主在脊椎动物上的病毒传染模式,提出SARS-CoV-2可能源自水貂[12]。2020年2月7日,华南农业大学发布会称从穿山甲中分离出的毒株的全基因组与SARS-CoV-2毒株相似度达90.3%[13].随后,美国研究者基于冠状病毒S蛋白上的与受体结合Motif的预测表明穿山甲携带的毒株与SARS-CoV-2具有高度的相似性[14]。关于SARS-CoV-2的来源,目前大多数研究者偏向源自于蝙蝠,中间宿主可能是穿山甲[15],传染途径如图3.近期,牛津大学的研究者表示SARS-CoV-2早在2019年爆发前就已潜伏于自然环境中。关于SARS-CoV-2的来源还有待科学界的进一步研究。

图3 SARS-CoV-2的可能传染路径[15]

病毒的突变导致病毒的进化,目前已有国外内多个科研团队基于不同的角度分析了SARS-CoV-2的进化情况。早期我国研究者基于样本的突变分析,将病毒分为L型和S型,L型由S型进化而来,更具有传播性[16]。随后英国剑桥大学和德国明斯特大学将我国研究者石正丽团队发现的与SARS-CoV-2高度相似的蝙蝠冠状病毒作为起源,分析了SARS-CoV-2的突变。结果发现,突变可以分为A、B、C三中类型,其中A型与蝙蝠冠状病毒关系更近,可能为原始祖先,这类主要分布在美国和澳大利亚;B型由A型演化而来,武汉地区的病例多为B型;C型由B型演化而来,多分布于欧洲地区[17]。目前,关于病毒进化的研究还在不断继续,有待进一步的大样本分析和深入研究。

4 病毒的流行病学及致病性

截止2020年7月5日,我国累计确诊85 320例,遍布全国338个城市,其中68 135例(84.99%)在湖北省;全国累计治愈80 161例,其中湖北治愈63 623例(79.36%);累计死亡4 648例,其中湖北省4 512例(97.07%)。根据世界卫生组织WHO官网数据,目前疫情已蔓延至全球192个国家和地区,累计确诊11 500 492例,死亡532 716例[18]。根据中国内地72 314例病例的流行病学特征分析,在确诊病例中(44 672例),大多数年龄在30~79岁(86.6%)、轻/中症病例为主(80.9%)、粗病死率为2.3%[18,19].有研究者基于基因组分析,发现SARS-CoV-2爆发可能于早于2019年12月[20]。流行病学研究表明,SARS-CoV-2的传染性更强,具有致使全国甚至全球大流行的潜在风险[21]。更令人忧心的是SARS-CoV-2潜伏期为1~14天,多为3~7天,而且初期症状不明显,因此导致其隐蔽性更强,更容易传播[22~24]。患者人群早期胸部影响学表现为局部病变,呈斑片状、亚段或节段性磨玻璃影,伴或不伴小叶间隔增厚;进展期病灶增多、范围扩大,累及多个肺叶[5,22]。重症期双肺弥漫性病变,少数呈“白肺”表现,实变影为主,合并磨玻璃影,多伴条索影,空气支气管征[5,22],如图4.而且,近期的研究表明SARS-CoV-2的攻击位点除了呼吸道外,研究者还发现在心脏、食道、胆管、回肠、肾、膀胱、睾丸等器官中均能检测到SARS-CoV-2受体ACE2的高表达,说明SARS-CoV-2也可能破坏这些器官[25~27]。

图4 轻症(A)和重症(B)新冠肺炎病人的CT图像[22]

5 病毒检测技术研究进展

目前,SARS-CoV-2的诊断主要结合流行病学、临床表现(呼吸道症状、医学影像学、血常规)、病原学证据(核酸检测)、免疫化学等方法来确定。由于其他病毒性和细菌性肺炎在临床症状和医学影像学上可能存在重叠,因此选择不同的检测方法对于确诊来说尤其重要。

5.1 利用核酸检测病毒

核酸检测的方法有许多,各有优缺点。基因组测序技术可鉴定未知病原体,准确度高,但是不利于快速大量检测;巢式反转录PCR作为荧光定量的补充,但是检测效率和普及率低;生物芯片可以批量检测样品,但是费用高和设备要求高;逆转录环介导的等温扩增法可以实现现场筛查,但是结果易出现假阳性。逆转录数字PCR准确率和灵敏度高,但成本高。目前,核酸检测主要基于反转录荧光定量PCR,该方法灵敏度高、检测速度快,在病毒检测方面具有很大的优势,是目前检测病毒最常用的手段之一。该方法的步骤如图5:1)采集有临床症状病人的上呼吸道咽拭子样本;2)用核酸提取试剂盒提取样本的核酸;3)反转录,将提取的RNA反转录为DNA;4)采用定量PCR仪进行PCR扩增;5)在标准范围内检测到扩增产物的信号则说明样本中有新型冠状病毒的RNA;如果在规定范围内没有检测到扩张增信号,则说明样本中可能不含新型冠状病毒的RNA或者含量很低(图5)[28]。荧光定量RT-PCR涉及到核酸提取,引物特异性、温度、循环数等很多因素影响,有一定的局限性。

图5 核酸检测示意图[28]

5.2 免疫化学检测及其他手段

免疫化学手段是主要利用抗原与抗体特异性反应结合对抗原或者抗体定性定量的方法,该方法具有高度特异性和灵敏性。IgG为正常人体血清中最主要的抗体成分,是机体重要的抗菌和抗病毒抗体。IgM是初次体液免疫中最早出现的抗体,具有中和细菌和病毒的功能。当新型冠状病毒侵入机体后,血清中特异性抗体IgG和IgM含量增高。利用抗体与待检测病毒抗原相互作用这一特性,因此可以判断是否存在病毒感染[29]。检测结果IgG、IgM都为阳性表明处于感染期;IgG为阳性,IgM为阴性时,说明可能处于感染的中晚期;IgG为阴性、IgM为阳性,表明可能是处于感染早期;IgG和IgM都为阴性时,说明是无感染或者处于感染的潜伏期。

常见的免疫化学检测手段有胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光等方法。胶体金免疫层析法法无需复杂的仪器,操作简单,可直接目视判定结果,检测时间只需十几分钟,适合于现场快速筛查,但其准确度和灵敏度有限,可以作为SARS-CoV-2核酸检测的辅助方法。化学发光法具有灵敏度高,特异性强,检测范围宽的特点,但依赖于特定的化学发光仪,检测成本较高。酶联免疫吸附法灵敏度较高,载体标准化难度较低,但检测速度慢、易污染、步骤较为繁琐。在实际应用中,需要根据抗原抗体的特性设计不同的检测法,目前有双抗体夹心法、免疫抑制法、竞争法、直接法和间接法等类型。

6 展望

SARS-CoV-2自爆发以来,给人类健康造成重大威胁,引起大家重视。目前,许多科研工作者投入到该病毒的研究中去。各级政府及科研单位都相继启动应急科研项目。虽然科研人员研发了检测病毒毒株的方法,发现部分有效药物和疫苗,但急需找到该病毒的源头,切断其传染途径。

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