红花龙胆总多酚提取工艺优化及抗氧化活性检测

朱淼，严凯，翁贵英，王绪英

（六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州六盘水553004）

红花龙胆（Gentiana rhodantha Franch）为苗族常用药材，在苗药中被称为“锐定谋”，是龙胆科龙胆属多年生草本植物，同时也是2015版药典中新增品种[1-2]。红花龙胆主要分布于我国西南地区各省，全草可入药，具有清热利湿，消炎解毒的功效，被其生长地区的当地居民用于治疗肺炎、支气管炎、眼结膜炎等炎症以及痢疾、肺结核等感染，同时外用时还可治疗痈疖疮疡，烧烫伤等症，具有广泛的药理作用。

目前对于红花龙胆化学成分报道较少。罗君等[3]通过超高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术对红花龙胆95%醇提物的正丁醇萃取部位进行分析，共鉴定出环烯醚萜类、酚酸类、黄酮类、三萜类、苯甲酸碳苷类、吡喃酮类等共计33种化合物；陈云课题组[4]运用硅胶等多种色谱柱对红花龙胆化学成分进行分离纯化，得到并鉴定出10种酚类化合物和6种三萜类化合物共计16种物质。这些研究结果表明，红花龙胆中主要的化学成分为萜类化合物和多酚类化合物。除了红花龙胆的化学成分外，对于其生物活性也有所研究。方玉梅等[5]发现红花龙胆对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制活性，而王飞清等[6]发现红花龙胆对肺炎链球菌引起的肺炎具有防治作用。Kim课题组[7]研究发现，红花龙胆可通过其中的Rhodanthpyrone A和Rhodanthpyrone B两种化合物发挥抗炎作用，两种物质能够降低RAW 264.7细胞和巨噬细胞中一氧化氮合酶及环氧合酶2的表达，同时令炎症细胞因子和趋化因子表达下调，并抑制了NF-κβ途径。Xu等[8]的研究发现红花龙胆中含有抑制乙酰胆碱酯酶的化学成分，提示红花龙胆具有抗阿尔茨海默症活性。

鉴于现在对红花龙胆的生物活性研究报道较少，说明非常有必要对这种新增进入药典的药材做进一步研究，尤其目前对于红花龙胆的抗氧化活性尚无报道。本研究针对红花龙胆中一类主要的化学成分多酚类化合物进行提取，并利用响应面法对提取工艺进行优化，同时考察多酚提取物的抗氧化活性，为红花龙胆进一步的开发利用提供技术参考，同时为阐明红花龙胆的抗氧化性提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红花龙胆采于六盘水市，六盘水师范学院生物科学与技术学院植科教研室鉴定为龙胆属植物红花龙胆（Gentiana rhodantha Franch）的干燥茎叶；双氧水：德州格利洁消毒制品有限公司；酒石酸钾钠、邻苯三酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、水杨酸、L-抗坏血酸、硫酸亚铁、没食子酸（均为国产分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

超声波清洗机（SB-800DT）：宁波新芝生物科技股份有限公司；中药粉碎机（DFT-200）：海新诺仪器设备有限公司；电子天平（AUW120D）：日本岛津公司；紫外分光光度计（UV-2100）：北京东西分析仪器有限公司；烘箱（HH-2A型）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备

取新鲜红花龙胆茎叶自然风干后，再放置60℃烘干至恒重，粉碎过40目筛，待用。

1.3.2 标准曲线绘制

多酚含量测定采用酒石酸亚铁显色法[9]。取0.1250 g没食子酸对照品加水定容至250 mL，配置成浓度为0.5 mg/mL 的对照品溶液，取该对照品 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 加入到 10 mL 容量瓶中，加水补至2 mL，再分别添加2 mL酒石酸亚铁溶液后，用pH7.5的磷酸盐缓冲液补齐至10 mL，放置室温10 min后，在540 nm处测定吸光度。得到线性回归方程y=14.13x-0.021 1（R2=0.998 5）。

多酚得率/%=提取液中多酚质量/茎叶干粉质量×100

1.3.3 样品多酚提取流程

称取0.5 g待测样品，加入乙醇溶液，混匀后在超声功率800 W的条件下进行多酚提取。将提取液以3 000 r/min离心5 min取上清。吸1 mL上清液至10 mL容量瓶内，加水补至2 mL，再添加酒石酸亚铁溶液2 mL，用pH7.5的磷酸盐缓冲液定容至10 mL后混匀，静置10 min，于540 nm处进行吸光度检测。

1.3.4 单因素试验

在料液比 1：60（g/mL），乙醇体积分数 50%时，检测超声时间为 10、20、30、40、50、60 min 时，红花龙胆的多酚得率；在超声时间 30 min，料液比 1：60（g/mL），检测乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%时，红花龙胆的多酚得率；在超声时间30 min，乙醇体积分数 50%时，检测料液比为 1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1 ∶80、1 ∶90（g/mL）时，红花龙胆的多酚得率。以上所有条件保持超声功率800 W不变。

1.3.5 响应面试验

根据单因素（时间、料液比、乙醇体积分数）试验结果，选取每个因素中对多酚得率影响较大的3个数值作为试验因素，以多酚类化合物得率为响应值，根据Box-Behnken设计原理优化红花龙胆的多酚提取工艺，因素水平表见表1。

表1 响应面因素水平表Table 1 Variables and levels in the response surface experiment design

1.3.6 抗氧化试验

将红花龙胆多酚提取物稀释成不同浓度后，进行羟自由基清除率[10]与超氧阴离子自由基清除率[11]检测，并以VC做阳性对照。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 超声时间对多酚类化合物得率的影响

超声时间对总多酚得率的影响见图1。

图1 提取时间对总多酚得率的影响Fig.1 Effect of exetraction time on the yield of polyphenols

由图1可知，当超声时间在30 min时，红花龙胆的多酚得率达到最大，超过30 min后，得率有所下降，可能是由于随着超声时间的延长，一些热敏组分被破坏，导致多酚析出量有所下降。

2.1.2 乙醇体积分数对多酚类化合物的影响

乙醇体积分数对多酚得率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对多酚得率的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of polyphenols

由图2可知，当乙醇体积分数达到50%时，多酚类化合物的得率达到最大，随着乙醇体积分数的进一步增加，多酚得率有所下降，可能是此浓度下的有机溶剂与红花龙胆中的多酚极性比较接近，导致多酚类化合物析出量较多。

2.1.3 料液比对多酚类化合物得率的影响

料液比对多酚得率的影响见图3。

图3 料液比对多酚得率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polyphenols

由图 3 可知，在料液比 1 ∶60（g/mL）时，红花龙胆多酚得率基本达到最大。随着液体体积的增大，多酚得率基本不再增加，说明在料液比1∶60（g/mL）时红花龙胆中多酚类化合物基本完全溶解。

2.2 响应面法分析结果

2.2.1 回归模型的建立与分析

以红花龙胆多酚得率为响应值，根据Box-Behnken原理设计三因素三水平响应面分析试验，结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results

得到各因素（多酚得率R、提取时间A、乙醇体积分数B、料液比C）拟合回归方程：R=-45.454 00+0.257 80A+0.635 50B+1.036 85C+1.275 00×10-3AB-4.750 00×10-4AC-3.750 00×10-4BC-4.942 50×10-3A2-6.592 50×10-3B2-8.542 50×10-3C2。

根据上述回归模型得到各项系数显著性检验结果和方程方差分析结果，见表3。

表3 响应面试验结果方差分析表Table 3 Analysis of variance of each term in the response surface regression model

该回归模型具有极显著差异（P=0.000 6＜0.01），其失拟项不显著，表明该回归模型与实测值之间具有较好的拟合度，其中A2、B2、C2对红花龙胆多酚得率有极显著的影响，C对红花龙胆多酚得率有显著影响。3个因素对红花龙胆多酚得率的影响依次为C＞B＞A，即料液比＞乙醇体积分数＞提取时间。

2.2.2 回归模型响应面分析

通过Design-Expert对表2中的数据进行了三元二次回归拟合后得到响应面图，如图4所示，AB、AC、BC响应面坡度平缓，说明他们之间的交互作用对红花龙胆的多酚得率影响较弱。

图4 各交互因素对多酚类化合物得率的影响Fig.4 Response surface plots of each pair of interaction factors on the extraction rate of polyphenols

2.2.3 工艺优化验证试验

通过响应面分析后的优化工艺为：提取时间29.62 min，乙醇体积分数 49.39%，料液比 1∶58.78（g/mL）时，红花龙胆多酚得率为4.53%。为便于操作，将最优工艺修正为：提取时间30 min，乙醇体积分数49%，料液比1∶59（g/mL），在此条件下，进行3次平行试验，得到多酚的实际得率为4.61%，相对标准偏差为2.26%，与预测值4.53%的相对误差为1.74%。

2.3 抗氧化活性检测结果

羟自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率见图5和图6。

图5 红花龙胆多酚提取物和VC的羟自由基清除率Fig.5 Hydroxyl radical-scavenging activity of Gentiana rhodantha Franch and VC

图6 红花龙胆多酚提取物和VC的超氧阴离子自由基清除率Fig.6 Superoxide radical scavenging activity of Gentiana rhodantha Franch and VC

由图5和图6可知，随着红花龙胆多酚含量的不断增加，提取物对羟自由基及超氧阴离子自由基的清除能力也逐渐增强，其线性拟合方程分别为：y（羟自由基）=186.7x-10.492，R2=0.995 7；y（超氧阴离子自由基）=187.85x-9.097 9，R2=0.996 1，均表现出良好的线性关系，其IC50分别为0.324 mg/mL和0.315 mg/mL。

3 结论

红花龙胆作为一种地区性的民族用药，现已开发了多种与之相关的复方配伍剂，本试验通过超声辅助提取其多酚类化合物，并采用响应曲面试验确定其多酚提取的最佳工艺，并考察所得提取物的羟自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力。结果表明，最佳提取工艺为：在提取时间30 min，乙醇体积分数49%，料液比1∶59（g/mL）的条件下，红花龙胆多酚得率为4.61%。其对羟自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率的IC50分别为0.324mg/mL和0.315mg/mL，表现出较好的抗氧化活性。