黄瓜果瘤位置性状遗传与QTL分析

郭晓雨 宋晓飞 李晓丽 孙成振 闫立英

摘    要：黄瓜为重要的蔬菜作物，解析黄瓜果瘤位置性状遗传规律与QTL定位，对深入研究果瘤位置形成分子机制和新品种选育有重要意义。以果瘤上移自交系X1（P1）和果瘤下移自交系X2（P2）为亲本构建F2群体，进行表型鉴定，解析遗传规律。分别选取20株果瘤上移和20株果瘤下移极端表型植株，构建果瘤上移池（Tu）、果瘤下移池（Td）和亲本池（Mp、Pp）并进行高通量测序（BSA-seq）。结合生物信息学分析，预测与黄瓜瓜把果瘤位置相关的QTL。根据黄瓜果瘤位置表型数据分析，P1平均值均为负值，为果瘤上移，P2平均值均为正值，为果瘤下移;F1倾向于母本，F1反倾向于父本，F2在5.22～6.14间为高亲值（接近父本），在0.23～2.32间为低亲值（接近母本），黄瓜果瘤位置表现为数量性状，F2更趋向于果瘤下移。预测到的候选基因主要与细胞的新陈代谢（CsaV3_1G009410、CsaV3_1G012820、CsaV3_1G028340）、信号转导（CsaV3_1G012480、CsaV3_4G029960、CsaV3_1G030640、CsaV3_1G029520、CsaV3_1G004360）、结构蛋白（CsaV3_1G030620、CsaV3_5G004870、CsaV3_1G031140），以及细胞激酶（CsaV3_1G033300、CsaV3_4G034190）和植物激素（CsaV3_5G015510）有关。根据△All-index在染色体上的分布推断位于1号染色体（5.840～18.376 Mbp）的CsaV3_1G030610、CsaV3_1G029520和CsaV3_1G030640为主要候选基因。CsaV3_1G030610中的阿魏酸与细胞壁形成有关;CsaV3_1G029520中的拟南芥SMAX1家族基因，作为KAR/SL信号分子调控种子萌发、根毛的形成与伸长;CsaV3_1G030640编码与ARIA相互作用的ap2结构域蛋白ADAP，正调控ABA信号，进而影响生长发育。因此推测果瘤位置的形成与细胞壁相关基因及信號转导有关。推测定位于黄瓜1号染色体重叠区域（5.840～18.376 Mbp）的候选基因CsaV3_1G030610主要参与细胞壁形成，与果瘤有关联，推测其与黄瓜果瘤位置性状有关系，但还需进一步研究。

关键词：黄瓜;果瘤位置;BSA-seq;QTL定位

中图分类号：S642.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2020）09-012-06

Abstract： Cucumber is an important vegetable. The analysis of the genetic rules and QTL mapping of cucumber tuberculate fruit position is of great significance to deeply study the molecular mechanism of the formation of tuberculate fruit position and breed new varieties. The F2 population was constructed with the X1 （P1） inbred upward inbred line and X2 （P2） inferior inbred downward line to carry out the phenotypic identification and analyze the genetic rules. Select twenty sarcoma upshift and 20 sarcoma downshift extreme phenotypic plants respectively to construct sarcoma upshift pool （Tu）， sarcoma downshift pool （Td） and parent pool （Mp， Pp） for high pass quantitative sequencing （BSA-seq）. Combined with bioinformatics analysis， it predicts QTL related to the location of cucumber gourd. According to the phenotypic data analysis of the position of cucumber tuberculate fruit， .the tuberculate fruit position shows a quantitative trait， and F2 more tends to tuberculate fruit is low down. It is speculated that the formation of the tuberculate fruit position is related to cell wall related genes and signal transduction. This study predicts that the candidate genes CsaV3_1G030610 is mainly involved in cell wall formation and is related to tuberculate fruit， which is located in the overlapping region of cucumber chromosome 1 （5.840-18.376 Mbp）. It is speculated that they are related to tuberculate fruit position and need to further research.

Key words： Cucumber; Tuberculate fruit position; BSA-seq; QTL

黄瓜（Cucumis sativus L.）属葫芦科蔬菜作物，在世界范围内广泛栽培。黄瓜瓜把上的果瘤位置是重要的外观品质性状，消费者更倾向于购买果瘤偏上的黄瓜。研究黄瓜果瘤位置的遗传规律及QTL定位，不仅有利于解析黄瓜果瘤位置形成的分子机制，而且有利于推动黄瓜品质育种的进程。王桂玲等[1]研究表明，果瘤是由Tu（Tuberculate）控制的单基因显性遗传。关媛[2]报道发现，无毛基因gl对果瘤基因Tu具有隐性上位作用，这表明有毛基因Gl是果瘤形成过程的必要基因。曹辰兴等[3]将黄瓜无毛自然突变体命为glabrous（gl1），无毛gl对果瘤性状Tu具有隐性上位作用，有毛Gl是果瘤形成的必要条件。2014年杨绪勤等[4-5]对黄瓜果瘤基因Tu进行了精细定位，将Tu基因定位于两翼标记SSR7和SSR18之间，并获得候选基因31个，并表明Csa016861是Tu的候选基因，控制果瘤性状，Tu编码C2H2型锌指蛋白，刺是果瘤形成的條件。Tu可能是拟南芥ZFP6的直系同源基因，也可能调控CTK的合成。同年，任国良等[6]通过构建黄瓜果瘤基因（Tu）表达载体pCAMBIA2301-Tu，并且将pCAMBIA2301-Tu利用电击法成功导入农杆菌菌株GV3101中，进行农杆菌介导的黄瓜遗传转化研究，试验成功获得了8株阳性转化苗，转化效率为1.37%。2009年张微微等[7]、2013年蔡润等[8]和杨绪勤等[9]申请了关于黄瓜果瘤基因研究的相关专利，填补了我国黄瓜果瘤性状基因研究空白。有学者对细胞壁的组分以及结构进行了研究，发现其在植物生长发育和环境胁迫等领域都起到一定作用[10]并且通过蛋白组学对植物信号传导的作用机制进行研究[11]。黄瓜瓜把上的果瘤位置是重要的外观品质性状，但关于黄瓜果瘤位置的相关研究未见报道。笔者研究黄瓜果瘤位置遗传规律，解析紧密连锁的QTL标记，为果瘤位置相关基因功能研究奠定基础，为品质育种提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

以黄瓜课题组多代纯合黄瓜果瘤上移自交系X1为母本（P1）、果瘤下移自交系X2为父本（P2）进行杂交，获得F1、F1反、F1自交构建F2群体。采用穴盘育苗，2叶1心时定植，双高垄地膜覆盖，大行距80 cm，小行距50 cm，株距25 cm，所有材料定植于河北科技师范学院园艺科技学院园艺实验站黄瓜课题组普通日光温室，常规管理。

1.2 方法

2019年春季，于盛果期分别取父本、母本、F1与F2群体单株主蔓10节以上的商品瓜，测定果瘤位置，每株测5个商品瓜。具体测量方法为：①用直尺测量商品瓜瓜蒂至果瘤最底部的距离，即外瓜把长（L1）;②将果实纵切，测量种腔底部至瓜把端部的距离，即内瓜把长（L2）;③果瘤位置（TP）=L1-L2。TP为负值表明果瘤上移，为正值表明果瘤下移（图1）。

1.3 QTL定位方法

1.3.1 BSA混池构建 根据黄瓜果瘤位置表型鉴定数据，选择F2群体中果瘤位置极端上移和极端下移单株各20株，取健康植株25节以上伸展叶片质量约1 g，提取DNA，进行等量混合，构建果瘤上移池（Tu-up，Tu）、果瘤下移池（Tu-down，Td）。分别取父本、母本叶片，采用同样方法，构建母本池（P1）和父本池（P2）。

1.3.2 文库构建和测序 将检验合格的DNA样品通过Covaris破碎机随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit建库，DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。将构建好的文库利用Illumina HiSeqTM PE150进行测序。

1.3.3 对生物信息进行分析 对原始数据（Raw data）进行质控，获得有效数据（Clean data）。之后与黄瓜参考基因组进行对比，标记并注释SNP、InDel。以母本（P1）的基因测序序列作为参考标准，分别计算果瘤上移池和果瘤下移池在亲本间标记位点的SNP-index。其中，完全与母本（P1）相同的SNP-index为0;完全与母本（P1）不同的SNP-index为1。按公式△（SNP-index）=SNPindex（果瘤下移）-SNPindex（果瘤上移）计算参考Takagi[12]。

1.3.4 候选基因分析与预测 利用拟南芥数据库（https：//www.arabidopsis.org/）和黄瓜基因组数据库（http：//cucurbitgenomics.org/）对定位到的黄瓜果瘤位置相关基因进行同源比对，预测候选基因功能。

2 结果与分析

2.1 黄瓜果瘤位置性状遗传规律分析

黄瓜果瘤位置表型数据分析表明，P1平均值均为负值，为果瘤上移，P2平均值均为正值，为果瘤下移;F1倾向于母本，F1反倾向于父本（表1），F2表型数据符合正态分布（图2），在5.22～6.14间为高亲值（接近父本），在0.23～2.32间为低亲值（接近母本），说明黄瓜果瘤位置性状为数量性状遗传。

2.2 测序数据质量分析

混池构建方法：选择果瘤位置极端上移和极端下移单株各20株，构建果瘤上移池（Tu-up，Tu）、果瘤下移池（Tu-down，Td）。其中果瘤下移池（Td）数值与亲本池（P2）数值相近，平均值为5.54（表2）。

对亲本P1、P2及果瘤上移混池（Tu）和果瘤下移混池（Td）开展全基因组重测序，共得到25.126 G原始数据，过滤后4个样本有效数据量在4 168 933～8 197 167 M，总数据量为24.846 G。利用测序结果的Qphred数值（Phred Score，Q），计算碱基错误率，发现Q20≥95.47%、Q30≥89.64%，黄瓜果瘤位置QTL-Seq数据有效率在98%以上，说明测序质量高，GC含量在38.59%～39.12%之间（表3），可进行下一步分析。

以黄瓜基因组作为参考基因组，所有样本的Reads比对数/Reads总数在94.32%～95.51%之间，对参考基因组的平均覆盖深度在14.82 X～27.17 X之间，1 X覆盖度比率在98.3%以上，4 X覆盖度比率在91.30%以上（表4）。

2.3 黄瓜果瘤位置QTL定位

以亲本P1作为参考亲本，分析计算果瘤上移池与果瘤下移池在亲本间72 287个标记位点的SNP-index（即SNP的频率）。△SNP-index =SNP-index（果瘤上移池）-SNP-index（果瘤下移池）。以7条染色体位置为横坐标，以1 Mb为单位，1 kb为步长，绘制Tu池。根据混池之间基因频率差异筛选，对果瘤上移（Tu）与果瘤下移池（Td）间SNP和Indel进行统计。

SNP统计中2个子代池共有130 541个位点发生SNP突变，在外显子区域发现同义突变3 858个，非同义突变3 409个，终止子提前76个，终止子丢失16个，Ts/Tv为1.600。

InDel统计中2个子代池共有77 059个位点发生SNP突变，缺失造成的移码有191个，非缺失造成的移码有136个，插入造成的移码有236个，非插入造成的移码133个（表5）。

2.4 数据分析

统计2个极端混池测序的SNP-index和InDel-index，并计算子代池|△All-index|，通过设定Top5%的阈值，在95%的置信水平下，共检测到3个，为1号染色体（7.802～18.383 Mbp）、4号染色体（0.810～18.389 Mbp）和5号染色体（16.259～21.182 Mbp）。

以△SNP-index大于阈值的窗口作为候选区间，共检测到2个QTL区间，分别位于1号染色体（QTL1：2.741～18.376 Mbp）、5号染色体（QTL2：12.896～12.897 Mbp）。

以△InDel-index大于阈值的窗口作为候选区间，共检测到3个QTL区间，分别位于1号染色体（QTL3：5.840～20.316 Mbp）、4号染色体（QTL4：19.698～24.233 Mbp）、5号染色体（QTL5：3.165～20.574 Mbp）。

以上检测到的5个QTL区间，1号染色体中QTL1与QTL3重叠，5号染色体中QTL2与QTL5重叠，说明此区间为可靠性较高，应为重点关注QTL区间。推测重叠区域1号染色体（5.840～18.376 Mbp）、5号染色体（12.896～12.897 Mbp）为果瘤位置性状的候选区域（图3）。

2.5 候选基因的同源基因功能分析与预测

根据黄瓜基因组3个QTL的△SNP-index、△InDel-index、△All-index在染色体上的分布区间内共获得候选多态性标记位点50个，提取ANNOVAR的注释结果，共获得与黄瓜果瘤位置性状相关的候选基因16个，含有4个SNP位点，分别位于1号染色体、5号染色体上，12个InDel位点分别位于1号染色体、4号染色体和5号染色体上（表6）。

预测到的候选基因主要与细胞的新陈代谢（CsaV3_1G009410、CsaV3_1G012820、CsaV3_1G028340）、信號转导（CsaV3_1G012480、CsaV3_4G029960、CsaV3_1G030640、CsaV3_1G029520、CsaV3_1G004360）、结构蛋白（CsaV3_1G030620、CsaV3_5G004870、CsaV3_1G031140），以及激酶（CsaV3_1G033300、CsaV3_4G034190）和植物激素（CsaV3_5G015510）有关。

根据△All-index在染色体上的分布推断位于1号染色体（13.76～17.60 Mbp）的CsaV3_1G030610、CsaV3_1G029520和CsaV3_1G030640为候选目的基因。CsaV3_1G030610中的阿魏酸与细胞壁形成有关。CsaV3_1G029520中的拟南芥SMAX1家族基因，作为KAR/SL信号分子调控种子萌发、根毛的形成与伸长。CsaV3_1G030640编码与ARIA相互作用的ap2结构域蛋白ADAP，正调控ABA信号，进而影响生长发育。结合拟南芥功能注释得到3个主要的候选基因（CsaV3_1G029520、CsaV3_1G030640和CsaV3_1G030610），因此推测果瘤位置形成候选基因与细胞壁及信号转导有关。

3 讨论与结论

近年来，对于黄瓜的黑色果刺[13]、果肉厚度[14]、果皮光泽[15]、嫰果皮色[16]等性状都有相应的研究，但未见对黄瓜果瘤位置精细定位的研究报道。关媛[2]提出TTG1与黄瓜TTG1-Like同源，与表皮毛形成有关。2007年王桂玲等[1]研究筛选到5对与果瘤有关的SSR引物，试验研究发现，Tu基因主要位于4个标记构建的连锁群中，其中具体位置为CSWGATT01C-Tu-CSCT335，两侧标记的遗传距离为20.0 cM和14.1 cM。2013年任国良[17]利用图位克隆的方法克隆得到控制黄瓜果瘤性状的基因Tu，且发现Tu基因的完全缺失导致无果瘤性状的发生。杨绪勤[4]提出了黄瓜果实刺瘤性状形成的遗传网络机制，通过细胞学与外观形态观测，表明开花前2 d为果瘤起始阶段期，验证了Csa016861就是Tu基因，控制果瘤性状，Tu基因仅含有一个外显子，Tu基因为编码C2H2型锌指蛋白的基因。

本研究结果得到的候选基因变异类型均为上游区域（up-stream）变异。上游基因位于起始密码子之前，即5'端，包含启动子、操纵子等，主要起调控目的基因作用。拟南芥乙醛脱氢酶AtALDH1a（CsaV3_1G030610）催化松柏醛和芥子醛生成阿魏酸和芥子酸。阿魏酸（ferulic acid）与纤维素、半纤维素和木质素有关[18]，参与细胞壁的形成。

综上所述，推测位于1号染色体重叠区域（5.840～18.376 Mbp）候选基因CsaV3_1G030610主要参与细胞壁形成，与果瘤有关联，推测其与黄瓜果瘤位置性状有关系，但还需进一步研究。

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