黄芪治疗糖尿病肾病的网络药理学机制

饶雅雯， 刘敏， 孙治中

（广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease）是糖尿病严重的微血管并发症，可进展为终末期肾病，是糖尿病致死、致残的主要原因。我国糖尿病肾病在终末期肾病中占16.4%，未来可能会成为终末期肾病的首位病因[1]。而临床上，糖尿病肾病早期中医药治疗的介入，对延缓病情的恶化及发展有显著的疗效。中医学并没有糖尿病肾病这一病名，多从 “水肿”“关格” 方面论治，认为其总体病机为本虚标实，本虚指气阴两虚、脏腑内虚，尤其指脾肾两脏，标实多为燥热、瘀血、痰浊、水湿等。故具有补中益气、利尿托毒作用的黄芪是其常用的一味中药。有研究[2]表明，在2 884 篇中医治疗糖尿病肾病的文献中，黄芪是出现频次最高的药物，达2 204 次。由于中药成分具有多样性，目前，黄芪的研究多针对其中某一成分，其具体机制尚不明确。而网络药理学是基于系统生物学的理论，对药物的有效成分进行多靶点、多通路的生物系统网络图分析[3]。本研究基于网络药理学的技术与方法，对黄芪治疗糖尿病肾病的作用机制进行研究，以期为下一步的研究提供相关依据，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1. 1活性成分的获取以 “黄芪” 为检索词，通过中药系统药理学技术平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索其化学成分，将口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 作为活性成分筛选条件，筛查出符合条件的活性成分，点击其成分的详细信息，保存活性成分的2D结构。

1. 2预测黄芪相关靶点在Pubchem 数据库中检索筛选出的黄芪的活性成分，找出它们对应的smile号，保存为SDF文件，上传至SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）。 基于反向分子对接原理，依据成分的2D/3D结构进行靶点预测，得到黄芪的预测靶点。

1. 3糖尿病肾病相关靶点的获取及与黄芪预测靶点的映射以“diabetic kidney disease” 为检索词，通过Cards 数据库获取糖尿病肾病相关靶点。将黄芪的预测靶点与糖尿病肾病相关靶点进行映射，得到黄芪治疗糖尿病肾病的预测靶点。

1. 4蛋白相互作用（PPI）网络的构建通过String数据库获取黄芪治疗糖尿病肾病的预测靶点之间的 “蛋白-蛋白” 相关作用关系，导入Cytoscape 3.6.0软件作为黄芪治疗糖尿病肾病的PPI网络。

1. 5 Hub网络的提取通过Cytoscape 3.6.0 软件Tools 模块中NetworkAnalyzer- Network Analysis-Analyze Network 进行网络分析获取相关拓扑参数，选取节点连接度（Degree）的二倍中位数、“节点介度（Betweenness）” 和 “节点紧密度（Closeness）” 的中位数作为筛选依据，提取出Hub网络。

1. 6基因本体论（GO）富集分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析应用Cytoscape 3.6.0中ClueGO 插件，选择Biological Process（生物进程），对Hub 网络中的靶标进行GO 富集分析。通过DAVID 网站（https：//david.ncifcrf.gov/）对上述分析结果进行KEGG通路分析、筛选，得到显著富集（P ＜0.01）的通路，并按照Gene 数从大到小排序。结合文献检索，筛选出治疗糖尿病肾病的可能通路。找到其通路上的相关靶标，结合黄芪的活性成分，构建出 “黄芪活性成分-糖尿病肾病靶标-KEGG通路” 的网络图。并且选取与黄芪治疗糖尿病肾病的相关通路，使用OmicShare 网站（http：//www.omicshare.com/tools/）绘制通路气泡图。

1. 7分子对接验证成分与靶点的结合能力运用SystemsDock 网 站（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）对Degree值排名前5位的预测靶标与黄芪活性成分进行分子对接，通过比较与原生配体的结合分值大小来评价结合的稳定性。

2 结果

2. 1黄芪活性成分本研究以OB≥30%、DL≥0.18为活性成分筛选条件，共筛选出18 种化合物，其名称、相关参数及化学结构式见表1。

2. 2黄芪预测靶点以及活性成分-糖尿病肾病靶点网络构建在SwissTargetPrediction 数据库中筛选出18 种活性化合物对应的255 个靶点，依据成分的2D/3D结构进行靶点预测，筛选出853个靶点作为黄芪的预测靶点。将所得的黄芪预测靶点与GeneCards 数据库获取的3 629 个糖尿病肾病相关靶点相映射，筛选出黄芪可能与糖尿病肾病相关的靶点278个。

在Cytoscape 3.6.0 软件中导入黄芪的活性成分与糖尿病肾病相关的靶点，构建黄芪活性成分-糖尿病肾病靶点网络图（见图1）。如图1 所示，此网络中共包括296 个节点，其中包括18 个化合物和278个靶点，746条边。

表1 黄芪活性成分Table 1 Data of the active components of Radix Astragali

2. 3 PPI网络的构建将278个黄芪可能与糖尿病肾病相关的靶点导入String 数据库得到蛋白-蛋白相关作用关系，通过Cytoscape 3.6.0 软件，形成黄芪治疗糖尿病肾病的PPI 网络（见图2）。如图2 所示，此网络中共包括278 个节点，1 208 条边。图中节点大小是按Degree 值的大小形成，Degree 值越大，节点越大。

图1 黄芪活性成分-糖尿病肾病靶点网络图Figure 1 Network of active ingredients from Radix Astragali-diabetic kidney disease targets

图2 黄芪治疗糖尿病肾病的PPI网络Figure 2 PPI network of Radix Astragali for treatment of diabetic kidney disease

2. 4 Hub网络的提取及Hub中的靶标选取Degree的二倍中位数、 Betweenness 和Closeness 的中位数作为筛选依据，通过Cytoscape 3.6.0 软件得到Hub中的靶标，即黄芪治疗的糖尿病肾病关键靶点，提取出Hub网络（见图3）。

图3 Hub网络Figure 3 Hub network

结果关键靶点有12个，具体为蛋白激酶Bα亚型（AKT1）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素6（IL-6）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管内皮生长因子（VEGF）、 丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、热休克蛋白90α（HSP90α）、转录调节因子（JUN）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（CASP3）。

2. 5 GO富集分析应用Cytoscape 3.6.0 中的ClueGO 插件，进行GO 富集中的BP 分析，得到13 个功能组别（见图4）以及其占比饼状图（见图5）。结果中主要富集在MAPK cascade、peptidyl-tyrosine phosphorylation、myeloid cell differentlation、negative regulation of protein modifitication process 等功能组别上。

图4 GO富集分析功能组别图Figure 4 Functional group diagram for GO enrichment analysis

图5 GO富集分析功能组别占比饼状图Figure 5 Pie chart for functional group proportion by GO enrichment analysis

2. 6 KEGG通路分析通过KEGG 通路分析得到86 条通路，结合文献检索，筛选出治疗糖尿病肾病的可能通路为16 条，绘制通路气泡图（见图6）：Smad 信号通路、蛋白激酶B（AKT）信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路、Wnt 信号通路，mTOR 信号通路、酪氨酸激酶-信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）信号通路、一氧化氮合酶（NOS）信号通路、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信号通路、细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路、核因子kappaB（NF-κB）信号通路、环鸟苷酸—蛋白激酶G（cGMP-PKG）信号通路、T 细胞受体信号通路，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、环磷酸腺苷（cAMP）信号通路、Toll 样受体4（TLR4）信号通路、胰岛素生长因子（IGF）信号通路。

2. 7分子对接运用SystemsDock 网站对Degree值排名前5位的预测靶标与黄芪活性成分进行分子对接，根据DockingScore 值的大小通过GraphPiad Prism 7.0 软件制作出热图（见图7）。DockingScore值在4.25 以上认为分子与靶点有一定的结合活性，大于5.0 说明有较好结合活性，大于7.0 说明具有强烈的结合活性。热图结果显示，大部分Docking Score值高于4.25，提示黄芪活性成分与预测靶标有一定的结合能力。

图6 KEGG通路气泡图Figure 6 Bubble diagram for the KEGG pathway enrichment

3 讨论

目前针对黄芪的研究局限于单一成分、单靶点，其具体机制尚不明确，运用网络药理学可从分子水平对黄芪治疗糖尿病肾病的作用机制进行预测分析。

图7 黄芪治疗糖尿病肾病预测靶标与活性成分分子对接热图Figure 7 Heat map for molecular docking of predicted targets with active ingredients

预测结果表明，黄芪治疗糖尿病肾病的关键靶点有12 个，具体为AKT1、TNF、IL6、MAPK3、VEGF、MAPK1、MMP9、MAPK8、mTOR、HSP90α、JUN、CASP3。

其中，AKT1参与了蛋白合成、血管形成等机体新陈代谢细胞应答过程，故其导致糖尿病肾病发生主要与引起过度的细胞外基质在肾间质沉积相关[4]。TNF 则是通过启动一系列的炎症反应，导致细胞内膜损伤，肾小球滤过屏障受损，从而形成蛋白尿[5]。IL-6的过度表达，会导致肾小球系膜增生、肾小球基底膜厚度增加，进而导致蛋白尿的产生[6]。MAPK3、MAPK1、MAPK8 在糖尿病肾病的发病过程中，可能参与肾小球系膜细胞表型转化，导致肾小球细胞外基质堆积，造成肾小球硬化[7]。VEGF 可能与足细胞损伤相关，并可增加细胞内钙离子内流[8]。有研究[9]表明，高糖环境可诱导体外培养的足细胞高表达MMP9，且可能主要在浸润巨噬细胞、小管上皮细胞、足突状细胞、小球系膜细胞等处[10]。mTOR 导致糖尿病肾病的发生可能与抑制足细胞自噬反应相关[11]。HSP90α 可能通过影响eNOS 活性，引起内皮功能障碍[12]。而转录调节因子JUN 表达的增加，会诱导Nephrin 表达下调，引起足细胞功能异常[13]。

KEGG 富集通路分析发现16 条通路与糖尿病肾病发病密切相关，大多数已有临床或实验研究证据支持，少部分仍有待于进一步研究。Smad 信号通路主要是通过TGF-β1这一被公认为是具有致纤维化的细胞因子，参与糖尿病肾病中肾间质纤维化的过程[14]。PI3K 通路是胰岛素信号转导的主要途径，与葡萄糖代谢有着密切关系，PI3K 信号通路、AKT 信号通路在调控丝氨酸蛋白激酶-3β，进而在糖尿病肾病系膜细胞增生、细胞外基质积聚、上皮细胞-间充质转化等方面扮演重要的角色[15]。而PI3K/AKT通路的关键下游因子是NF-κB，NF-κB 信号通路的激活，进而介导炎症因子不断释放，加速糖尿病肾病的发生发展[16]。Wnt信号通路在糖尿病肾病病程中，一是通过β-catenin 的大量合成，激活促纤维化因子的释放，导致肾组织纤维化，二是Wnt-1 高表达，可诱导足细胞损伤，并加剧肾细胞的凋亡[17]。机体自身可以通过自噬调节减轻高血糖、高胰岛素血症等应激所导致的损伤，但mTOR信号通路的激活可能抑制机体的自噬调节，从而导致肾脏纤维化[18]。糖尿病肾病持续的高糖环境会激活JAK/STAT 信号通路，导致肾脏间质成纤维细胞大量增殖，引发肾间质纤维化[19]。JNK 通路能够被糖尿病肾病患者机体内应激、炎性细胞因子等多种因素激活，诱导足细胞凋亡，引起肾小球滤过功能障碍[20]。ERK信号转导通路可在高糖环境下被激活，引起细胞肥大及TGF-β 的表达上调，损伤足细胞，诱导免疫反应，导致糖尿病肾病的发生[21]。糖尿病肾病患者由于长期高血糖及代谢紊乱，使机体处于氧化应激状态，激活MAPK信号通路，既可介导TGF-β1诱生的系膜区基质沉积，也可进一步活化细胞凋亡因子Caspase-3，引起足细胞凋亡[22]。cAMP 信号通路可能是通过激活体内蛋白激酶A（PKA），调控水通道蛋白5（AQP5），影响尿液的浓缩稀释功能，最终造成肾小球滤过功能障碍[23]。TLR4 信号通路是Toll样受体信号通路中的一类，是介导炎性反应信号通路，巨噬细胞的浸润导致肾间质单核细胞局部广泛聚集，且与肾小球硬化指数和程度呈正相关[24]。有研究发现，IGF 信号通路可以抑制糖尿病肾病中肾小管上皮间质细胞分化[25]。

综上所述，本研究基于网络药理学的方法和技术，预测了黄芪通过多成分、多靶点、多通路治疗糖尿病肾病的作用机制，认为黄芪可能是通过抑制促纤维因子的释放，抑制炎症因子分泌，参与抗炎反应，调节自噬功能，降低氧化应激等，进而改善糖尿病肾病肾功能，延缓病情发展。此为进一步深入探讨黄芪治疗糖尿病肾病的药效物质基础及作用机制指明了研究方向。