四川省邻水县发现武陵洞蛭

任伯凇，黄太福，伍丽艳，袁小玥，刘志霄*

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首416000;2.湖南壶瓶山国家级自然保护区管理局，湖南石门415000)

山蛭俗称山蚂蟥，主要生活在热带和亚热带的丛林和草丛中，属环节动物门Annelida蛭纲Hirudinea山蛭科Haemadipsidae(杨潼，1996)。全球现已知该科4属2组，其中3颚蛭组3属，2颚蛭组1属。分布于中国境内的是3颚蛭组的山蛭属Haemadipsa、三颚四环蛭属Tritetrabdella和中国洞蛭 属 Sinospelaeobdella(Apakupakul et al.，1999;Trontelj ＆ Utevsky，2005;Borda et al.，2008;Lai et al.，2011;Tessler et al.，2016;Huang et al.，2019)。

中国洞蛭属由Huang等(2019)建立，目前仅记录2种，分别为洞穴山蛭S.cavatuses和武陵洞蛭S.wulingensis，均为真洞穴动物。前者分布于云南南部和西部边境(杨潼等，2009;郭云胶等，2010)，后者发现于湖南湘西州永顺县、古丈县和吉首市境内的几个溶洞中。最近在四川省广安市邻水县进行调查时，发现并采集了2条洞蛭标本。综合形态特征和分子数据，将其鉴定为武陵洞蛭Sinospelaeobdella wulingensis，为四川省洞穴陆生蛭类的首次分布记录。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用样本共计2条(编号:20190408-1，20190408-2)，2019年4月张涛等人在四川省广安市邻水县老龙洞(106°51'48.77″E，30°21'16.57″N，海拔895 m)发现并采集。标本均用95%乙醇固定保存于吉首大学生物资源与环境科学学院动物标本室。

1.2 方法

1.2.1 形态观察 依据蛭类测量方法(杨潼，1996;丁鲁民，2004;Lai et al.，2011)，使用数显游标卡尺(精度0.01 mm)测量标本的外形(体长、头宽、最大体宽和尾吸盘径长)，并用体视显微镜(Motic-SMZ168)进行解剖观察。

1.2.2 DNA的提取、扩增与测序 取标本的部分尾吸盘组织放入100%乙醇中，用1%浓度的磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗2次之后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(B518251)完成整个DNA的提取过程。提取成功后，用1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA模板，并于－20℃保存备用。线粒体COⅠ基因序列采用通用引物LCO1490/HCO2198进行扩增(Folmer et al.，1994;Guan ＆ Gao，2008)。PCR反应体系总体积 50 μL:0.5 μL 模板、5 μL 10 ×PCR Buffer、4 μL 25 mmol· L－1dNTP、0.5 μL 10 μmol·L－1引物、0.5 μL Taq 酶、ddH2O 补足50 μL。PCR反应条件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，49℃ 30 s，72℃ 1 min，循环30次;72℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化后测序，并对测序结果进行拼接。

1.2.3 数据处理 测序结果用Chromas 2.33查看峰值，利用DNAstar 7.1对拼接序列进行编辑校正。选用MEGA 5.0基于Kimura双参数模型(Kimura 2-parameter)计算全部碱基替换情形下的序列间遗传距离并统计碱基组成、信息位点、保守位点等(Kimura，1981)。以最大似然法(Maximum Likelihood，ML)构建系统发育树，进化树各分支的置信度采用1 000次自检分析进行重复检验。

2 结果与分析

2.1 形态特征

四川(洞蛭)标本(表1)体型中等，前1/3段体小而细，白色或微红色，体后2/3明显较前段宽大，呈红褐色(乙醇浸泡后的标本呈米白色)，但皮肤表面本身缺乏色素且背面各环上具乳突和背部感受器，腹面不明显。身体可见27体节共94环，完全体节的环数为5环;雌、雄生殖孔分别位于33/34(Ⅻ:b2/a2)、35/36(Ⅻ:b5/b6)环的腹中环沟上间隔2环。口吸盘口孔较大，边缘呈瓣状，有颚3枚。尾吸盘近圆形且较大，径长(4.63/5.30)超过最大体宽，背面也有乳突。眼点5对，第2对眼最大、第5对眼仍然存在(图1)。背部乳突较小。

图1 四川洞蛭标本的外形特征Fig.1 The external morphological characteristics of Sichuan cave-dwelling leech specimens

2.2 分子鉴定

有效获得了线粒体COⅠ基因序列681 bp，NCBI Blast程序检测显示，与武陵洞蛭相似度最高达到95.74%，与洞穴山蛭的相似度为90.14%。在COⅠ序列中含有保守位点558个，变异位点95个，信息位点71个。基于线粒体COⅠ基因使用最大似然法构建的系统发育树显示，四川标本和武陵洞蛭关系更为接近(图2)。双参数模型计算的遗传距离显示，四川标本与武陵洞蛭相差4.5%，与洞穴山蛭相差10%。

表1 武陵洞蛭和洞穴山蛭形态特征比较Table 1 The morphological traits of Sinospelaeobdella wulingensis and S.cavatuses

图2 基于线粒体COⅠ基因构建的最大似然树Fig.2 Maximum Likelihood(ML)tree based on sequences of mitochondrial COⅠgene

表2 基于COⅠ基因计算的中国洞蛭属种内及种间的遗传距离Table 2 The uncorrected pairwise genetic distance in the Sinocavebdella based on COⅠgene analysis

3 讨论

此次采集的四川标本具颚3枚，生殖孔间隔2环，第2对眼最大，第5对眼仍然存在，体背部的乳突较小等结构特征与武陵洞蛭相同而异于洞穴山蛭。且体长、头宽、最大体宽和尾吸盘径长等测量值也与武陵洞蛭相符。同时，分子数据显示其亲缘关系更接近于武陵洞蛭。遗传距离也显示，四川标本和洞穴山蛭差异大(10%)而与武陵洞蛭差异较小(4.5%)。综合形态学与分子数据，暂将四川标本鉴定为武陵洞蛭。然而，四川标本与武陵洞蛭间的差异，特别是遗传距离达到4.5%，究竟是种内交流阻隔所致，还是已达到亚种或新种的分化水平，仍有待采集更多标本并采取多基因乃至基因组综合性的深入研究予以厘清。

致谢:感谢四川小寨子沟国家级自然保护区管理局张涛、四川省邻水县自然资源和规划局万峰山森林公园梁国平在标本采集方面给予的帮助;感谢吉首大学生物资源与环境科学学院彭清忠教授和黄兴龙博士在分子数据方面的鼎力支持与帮助。