线粒体缺氧性损伤及其法医学意义

胡毅恺，张恒，肖碧，陈龙

（1.复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032；2.上海市公安局物证鉴定中心 上海市现场物证重点实验室，上海 200083）

机械性窒息是指机械性暴力作用引起呼吸障碍所导致的窒息，其案发率仅次于机械性损伤，在我国暴力案件中排名第二[1]。目前机械性窒息的法医学鉴定主要依靠缢痕、勒痕和一些非特异性的尸体征象（颜面水肿、器官淤血等），面对现场遭到破坏的复杂案例往往因缺乏特异性标志物而难以完成精准鉴定。线粒体对于缺氧环境极为敏感，其损伤标志物或可作为诊断机械性窒息的依据，本文将阐述线粒体（mitochondrion）在缺氧环境中发生的特异性变化，并探讨其运用于法医学实践的可能性。

1 线粒体

线粒体是真核细胞中一种独特的细胞器，具有多形性、易变性、运动性和适应性等特点。线粒体的主要功能是通过氧化磷酸化合成腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），为细胞活动提供能量。正常成年人经氧化磷酸化产生的能量占其机体产生总能量的80%以上[2]。据报道，机体所摄入的氧气约90%在线粒体中被利用，其中2%经线粒体内膜电子传递系统（electron transfer system，ETS）产生氧自由基[3]，过量的氧自由基对细胞具有毒性作用[4]。缺氧时，ETS及氧化磷酸化途径发生障碍，ETS中酶活性受到抑制，ATP合成受阻，产生过量氧自由基，使得线粒体受到损伤，进而导致细胞受损[5-6]。近年来，越来越多的学者开始研究机体缺氧情况下线粒体的损伤及其机制。

2 缺氧状态与机械性窒息

缺氧是指组织氧供减少或不能充分利用氧导致组织代谢、功能和形态结构发生异常变化的过程，人体组织中正常氧分压水平约为3.2～8.8kPa（24～66mmHg），各组织对于缺氧的耐受性存在较大差异，神经细胞、心肌细胞等对缺氧较为敏感，而骨骼肌细胞、胃肠道平滑肌细胞及精细胞等对缺氧的耐受性较好。当组织含氧量低于正常水平时，机体即进入缺氧状态。根据不同的病理生理机制，缺氧可细分为低张性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧及组织性缺氧等[7]。

机械性窒息是指机械性暴力引起呼吸障碍所导致的窒息，根据暴力的作用方式，可分为缢死、勒死、扼死、压迫胸腹部所致窒息、捂死、闷死及梗死等多种形式。目前已有学者尝试通过检测死后血液pH值变化、血气分析[8]、血液离子浓度改变[9]、缺氧相关蛋白表达水平[10]、mRNA及miRNA标志物水平[11-12]等诸多方法以推断机械性窒息死亡。

机械性窒息的本质是缺氧引起的中枢神经功能障碍、呼吸和循环功能衰竭[13]，且持续时间往往较短，一般在数分钟内即可致人死亡。而在急性缺氧情况下，大量氧自由基诱发的脂质氧化反应、Ca2+超载、氧化磷酸化受抑制等一系列变化，都可以造成线粒体的损伤，在形态学上表现为线粒体肿胀、脊断裂溶解、外膜破裂和基质外溢等[14]。

3 线粒体损伤在缺氧中的研究进展

3.1 缺氧引起线粒体膜电位的降低

在缺氧环境下，机体线粒体膜电位的降低是受损的表现之一[15]，目前认为其机制主要与线粒体解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）活性的上调和线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的开放相关。

由氧化磷酸化解偶联引起的能量合成下降以及耗氧效率降低，被认为是线粒体受损的最主要特征[16]。UCP是线粒体载体蛋白家族的一个亚族，定位于线粒体内膜，可将线粒体内膜外的H+转运至基质，降低线粒体的跨膜质子电动势[17]。MURRAY等[18]发现在慢性心衰模型的大鼠心肌细胞中UCP3的表达量增加了53%，而其磷氧比值（adenosine diphosphateoxygen ratio，ADP/O）相比于对照组则明显降低。研究[19]发现，白藜芦醇可以通过抑制脑缺血大鼠UCP2的表达达到提高线粒体ADP/O的作用，进而减轻缺氧缺血性损伤对脑组织的损害。以上研究表明，UCP的活性增强并引起线粒体膜电位的降低是缺氧环境下线粒体损伤的重要表现之一。

mPTP开放的增强是导致线粒体膜电位降低的另一个主要因素[20]。在缺氧环境下，细胞膜表面的Na+-K+-ATP酶难以正常工作，线粒体及内质网内Ca2+外流以及谷氨酸受体启动增加等因素都可以导致细胞基质内Ca2+数量上升，造成细胞基质内钙超载，可能导致细胞mPTP开放[21]，mPTP的开放可引起线粒体膜电位的下降，最终致ATP的耗竭[22]。

3.2 缺氧造成线粒体自噬

自噬是机体对物质进行循环利用并修正自身错误的机制之一，线粒体自噬是指机体自身在精密调控下通过溶酶体清除线粒体的过程[23]。低氧环境可以诱导机体发生线粒体自噬，这一过程主要与Bcl-2/E1B-19000相互作用蛋白3（Bcl-2/E1B 19000-interacting protein 3，Bnip3）和 Bcl-2/E1B-19 000相互作用3样（Bnip3-like，Bnip3L）蛋白通路的激活相关，Bnip3及其同系物Bnip3L的N端含有一个WXXL样的基序，在其与自噬相关蛋白8（autophagy-related protein 8，ATG8）的结合中作用，而Bnip3蛋白与ATG8的结合有助于线粒体与自噬体的对接，促进自噬的发生[24]。此外，该通路激活可竞争性地将Beclin-1从Bcl-2-Beclin-1或Bcl-XL-Beclin-1复合物中游离出来，游离状态的Beclin-1可以参与Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PIK3）复合体，该复合体可以调节多种Atg蛋白在自噬前体结构中的定位，从而激活自噬的发生[25]。目前发现，Bnip3及Bnip3L途径的激活主要受到缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）和线粒体内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的影响[26]。

研究显示，在机体缺氧条件下，HIF对于细胞代谢，血管再生，血细胞生成，细胞增殖、分化及凋亡等过程起着重要的调节作用[27]。HIF-1由对氧分压敏感的α亚基和对氧分压不敏感的β亚基构成[28]，在缺氧条件下，HIF-1α降解途径受阻，进入细胞核与HIF-1β合成HIF-1[29]。HIF-1可以激活Bnip3通路以及Bnip3L通路，从而促进线粒体自噬的发生。此外，在缺氧环境下，线粒体内大量ROS生成。ROS能够激活HIF-2α，并增加Bnip3的表达，以此促进线粒体自噬的发生[30]。另外，ROS对于核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）也有激活作用，Nrf2因子可以诱导p62蛋白的表达，p62可以与轻链3（light chain 3，LC3）相互作用以促进线粒体自噬的发生[31]，也有研究[32-34]指出，蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）因子的激活、PTEN诱导激酶（PTEN-induced putative kinase，PINK）的激活及线粒体内腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）的堆积等因素均对低氧环境下线粒体的自噬有促进作用。

3.3 缺氧导致线粒体分裂

在细胞面临代谢或环境应激时，线粒体融合与分裂的平衡对细胞功能的维系有重要意义，其中，线粒体的分裂可以产生新的线粒体。在应激条件下促进移除受损的线粒体以维持线粒体的质量[35]。目前已有学者发现，线粒体的分裂主要由胞质动力蛋白家族成员线粒体发动蛋白相关蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）和线粒体分裂 1（mitochondrial fission 1，Fis1）蛋白共同介导。

缺氧作为一种强烈的应激源可以诱发细胞内线粒体的分裂[36]。有学者通过动物实验发现缺氧能够诱导小鼠胚胎成纤维细胞线粒体的分裂[37]。有报道[38]指出，当缺氧导致细胞内钙超载时，胞质中的Ca2+可激活钙调磷酸酶，使DRP1（S637）去磷酸化，导致其从细胞质基质中聚集到线粒体外膜，促进线粒体分裂。此外，也有学者[39]指出，大量ROS可以促使DRP1（S616）磷酸化水平升高，进而活化DRP1，促进线粒体的分裂。

目前，学界普遍认为适度的线粒体分裂有助于清除受损的线粒体，但过度的线粒体分裂可能会导致细胞的死亡[40]，其具体意义及机制尚待进一步研究。

3.4 缺氧诱导经线粒体途径的细胞凋亡发生

缺氧窒息可以诱导线粒体途径的细胞凋亡，在生理条件下，促凋亡因子［Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Bcl-2同源拮抗剂（Bcl-2 homologous antagonist/killers，Bak）等］与抗凋亡因子［B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、B细胞淋巴瘤-XL（B cell lymphoma-XL，Bcl-XL）等］结合，不具有凋亡活性。当细胞受到外界强烈刺激时，激活BH3-only蛋白（Bcl-2 homology-3 domain only protein），竞争性抑制促凋亡因子与抗凋亡因子的结合，游离的促凋亡因子可以在线粒体外膜上形成蛋白通道，促使细胞色素C（cytochrome C）及第二线粒体源性半胱天冬酶激活剂（second mitochondria-derived activator of caspases，SMAC）释放进入细胞质。而后细胞色素C介导caspase-9的激活，SMAC则封闭X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）对caspase的抑制作用，最终导致细胞的凋亡[41]。还有学者[42]发现，位于线粒体的Bax/Bak除可以介导细胞色素C的释放外，还可以调控线粒体内凋亡相关因子的核转运，从而进一步促进细胞凋亡的发生。

已有研究[43]发现，在新生儿发生缺氧缺血后，Bax从Bcl-2及Bcl-XL上释放，并向线粒体转运，导致细胞凋亡。国内也有学者[44]对肺泡上皮细胞在缺氧后受到的损伤进行了研究，发现肺上皮细胞在缺氧环境下也会诱发凋亡的发生。另有学者利用转基因小鼠进行试验，发现当XIAP表达量上升时，缺氧缺血对其大脑的损伤作用有所减轻[45]，这也从侧面印证了缺氧环境确实可以通过线粒体途径诱发细胞的凋亡。

4 线粒体损伤在机械性窒息死因鉴定中的法医学意义

法医学实践中对窒息死亡的案例通常根据死者颜面部发绀、内部器官淤血、“玫瑰齿”、上腔静脉回流综合征、Tardieu氏斑、尸斑弥漫暗紫红色以及颈部索痕、扼痕、呼吸道堵塞等尸体征象，在排除其他死因后，结合现场及案情分析方能给出“符合性”诊断。在面对案情不明、现场破坏或尸体征象不明显（如使用柔软物体覆盖口鼻）的情况下，对于机械性窒息的诊断就极为困难[46]。

线粒体是机体内消耗氧气并产生能量的重要细胞器，其对于缺氧的发生极为敏感，当机体面临缺氧环境时，线粒体可以出现包括形态改变、膜电位下降、自噬、线粒体蛋白渗入胞质及分裂等多种变化。在其他死因中，机体细胞在机体死亡后尚可利用机体血液中残存的氧气进行一定程度上的呼吸，缓慢走向细胞死亡，细胞所经历的过程是一个慢性缺氧的过程。而在机械性窒息发生时，机体在短时间内发生剧烈的缺氧，细胞经历的是短时间内急性缺氧的过程，对缺氧敏感的细胞（心、脑组织等）其线粒体有可能出现特征性的变化，这种变化如果能够被法医病理学工作者发现，将成为机械性窒息诊断的重要依据，且由于线粒体对于缺氧的敏感性，这些指标可以在案情不明或现场遭到破坏等情况下给案件的侦查提供有价值的方向性线索。

目前，法医学实践对线粒体的运用主要是将线粒体的DNA测序应用于法医物证学实践[47]，而线粒体缺氧指标有望作为组织经历缺氧窒息的证据，成为鉴定机械性窒息的辅助指标之一。基础医学对于线粒体缺氧条件下的研究多着眼于细胞在慢性缺氧或缺血-再灌注情况下其线粒体发生的变化[48-50]，也有许多研究着眼于肿瘤细胞中线粒体的特征性病理生理学改变[51-52]，涉及细胞急性缺氧死亡或集体窒息死亡后线粒体变化的研究较少。

5 展 望

线粒体是人体内与氧气消耗直接相关的细胞器，对缺氧极为敏感。但是目前对于线粒体的研究尚不完善，尤其是对于其运用于法医病理学实践的可能性的研究较少。

运用线粒体相关指标进行死因推断的难点主要在于：（1）线粒体易降解，对于保存的要求较高；（2）线粒体的提取较为复杂，对实验人员及实验室有一定的要求；（3）目前尚无成熟的可以运用于法医病理学实践的线粒体损伤标志物。针对以上问题，我们认为可以采取以下措施予以解决：（1）通过动物实验，探索线粒体的降解规律，划定可以运用线粒体损伤标志物的死亡时间范围；（2）探究更为完善的线粒体提取及检测技术，使线粒体损伤标志物可应用的死亡时间范围更为广泛；（3）进行动物实验，利用蛋白质谱技术，寻找在不同死亡原因中表达有所差异的蛋白质，围绕所发现的蛋白探索其相关通路上可以用作死因推断的指标，并在此基础上利用免疫印迹法、免疫荧光技术、实时荧光定量核酸扩增检测等相关技术对所发现的指标在动物实验样本及实际检案人体样本上进行验证，以期发现可以用作机械性窒息死因推断的线粒体相关指标。

随着对于线粒体损伤的研究逐渐加深，其标志物或有助于在某些情况下判定死因是否为机械性窒息，将成为法医病理学诊断中的一个重要补充。