mRNA和ncRNA在死亡时间推断中的研究进展

吕叶辉 ，王卓群 ，陈忆九 ，陈龙

（1.上海健康医学院基础医学院，上海 201318；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032）

死亡时间（postmortem interval，PMI），又称死后间隔时间或死后经历时间，通常是指发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔。对于刑事案件，PMI的准确推断可为侦查部门提供重要线索，有助于划定侦查范围、确定案件性质以及认定和排除嫌疑人等。对于死亡纠纷涉及仲裁、财产继承以及保险理赔的民事案件，PMI的准确推断亦可为司法实践提供重要的科学依据。因此，PMI的准确推断一直是法医学研究和实践的重点和难点。

PMI推断的方法较多，传统的方法如尸体现象（尸斑、尸冷及角膜变化等）、胃内容物消化过程、膀胱尿量、尸体周围植物生长变化规律及昆虫发育情况等[1]，可简单快速推断PMI，但由于体外环境因素的复杂性和多变性，推断误差较大，易受主观经验的影响，难以满足法医学实践中复杂多变的需求。近年来，随着分子生物学的快速发展及相关研究技术的进步，许多学者通过检测死后机体生物分子物质［如脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）[2-3]、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）[4-7]和蛋白质[8-9]等］的降解变化规律来推断PMI，取得了一系列研究成果。随着这些生物分子物质结构、种类和生物学特性被不断揭示，RNA在PMI推断中的应用价值得到深入挖掘，逐渐成为研究热点。本文综述了近20年来运用信使RNA（messenger RNA，mRNA）和非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）进行PMI推断的研究进展，并探讨了存在的问题及发展趋势，以期为相关研究和鉴定实践提供技术参考。

1 运用mRNA死后变化规律推断PMI

1.1 运用mRNA死后变化规律推断PMI的早期探索（2002—2009年相关研究）

2002年，INOUE等[10]首先探讨了mRNA作为PMI推断指标的可能性，运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术检测了大鼠脑组织中甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）在死后7 d内的循环定量（quantification cycle，Cq）值［也称循环阈值（cycle threshold，Ct）］，发现其与PMI之间存在良好的线性规律。2003年，BAUER 等[11]设计了 5′端到 3′端4个不同长度的脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）扩增产物（FAS1～4），用反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技术检测不同片段的含量，发现5′端片段的降解速率快于3′端；研究人员认为死后组织RNA的降解具有方向性，可依次选取合适片段作为PMI推断的指标。2004年，KOZHEMYAKO等[12]通过RT-PCR检测发现，诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在人体肝肾组织中仅死后3d内可检测到，而在脑组织中7d内都可检测到。同年，OHASHI等[13]运用qRT-PCR检测了乳腺组织中β-actin、GAPDH、核糖体磷蛋白大亚基P0（ribosomal phosphoprotein large P0，RPLP0）以及Sma和Mad相关蛋白2（Sma-and Madrelated protein 2，Smad2）的表达情况，发现上述管家基因在不同离体时间（10 min～3 h）样本中并无差异，从而得出了组织离体3 h内并无RNA损失及mRNA降解的结论。然而，GEHEEB等[14]在2005年发表评论文章，认为该论文作者错误理解了qRT-PCR的数据，上述结果可能是部分管家基因在死后早期转录活性增加和mRNA时序性降解共同作用导致的。

2006年，ZHAO等[15]运用Taqman探针法检测了红细胞生成素（erythropoietin，EPO）和GAPDH在尸体心、脑、肾和肺组织中的含量，以GAPDH为内参，EPO的相对表达量（2-ΔΔCq）在各组织中均随PMI延长显著上升。作者虽未明确解释EPO为何呈时序上升趋势，但其所用的探针和引物序列是人属特异性的，排除了死后机体微生物的影响。2007年，HEINRICH等[16]收集了不同PMI（15～118h）的尸检组织，并设计了不同扩增片段长度的GAPDH引物（GAPDH F1～F5，114～866 bp），结果发现，与肝、脾和肾组织相比，心、脑和骨骼肌组织中GAPDH的降解较为缓慢，甚至扩增片段最长的GAPDH F5都能在大部分脑和骨骼肌样本中检出。此外，文章作者详细讨论了不同扩增片段长度对定量的影响，认为在研究死后mRNA的稳定性时，应尽量选择小于150bp的扩增产物长度。同年，BAUER[4]发表重要综述，详细讨论了RNA在法医学领域的应用现状及前景，并总结性提出死后机体内mRNA的稳定性受众多因素的影响，如组织类型、环境温度及死前状态等。

与此同时，国内学者也开展了运用mRNA进行PMI推断的研究，所选择的指标主要是管家基因mRNA，特别是β-actin和GAPDH。2005年，肖俊辉等[17-18]运用RT-PCR和凝胶图像分析技术对断颈死大鼠进行检测，发现骨骼肌组织中β-actin在死后6d内可检测到，而心肌和肺组织中β-actin于死后12d仍可检出。2006年，梁赞姜等[19]运用同样办法，检测了麻醉死大鼠各组织中β-actin的最长检出时限，发现肝组织为死后4d，肾组织为8d，心肌组织为10d，而脾组织为12d。同年，朱方成等[20]运用复合荧光RT-PCR检测发现，在死后32 h内大鼠肾和脾组织中可检测到GAPDH mRNA，且表达产物含量（荧光强度）随PMI呈规律性下降趋势。但是，上述研究只进行了相关指标的半定量或定量分析，并未尝试建立方程进行PMI推断。

2007年，刘季等[21]用RT-PCR检测了窒息死大鼠脑组织中GAPDH的含量，发现其在2d内含量下降不明显，但在3～7d降解显著增加，且降解速度随温度升高而增加。同年，陈晓瑞等[22]运用复合荧光RT-PCR检测了大鼠视网膜内β-actin、磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）和核糖体蛋白L4（ribosomal protein L4，RPL4）的死后降解变化情况，并建立了线性方程推断PMI。2008年，朱方成等[23]也运用上述技术建立了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT）含量与PMI（0～36 h）的线性回归方程，认为HGPRT在大鼠肾组织中的检测时限比之前报道[20]的GAPDH更短，更适合进行早期PMI的推断。

2009年，任广睦等[24]先运用RT-PCR和凝胶图像分析技术定性分析了大鼠7个组织中GAPDH和β-actin的表达情况，在脾、脑组织中死后5 d内可检出，在心、肾组织中死后3d内可检出，而在肝、肺组织中仅死后1d内可检出。与INOUE等[10]和肖俊辉等[17]的研究相比，该研究存在管家基因mRNA检出时限缩短的现象，作者分析原因一是环境湿度较高使mRNA降解加速，二是RT-PCR敏感性较低。同年，任广睦等[25]运用更高效、敏感的qRT-PCR技术对大鼠脑和脾组织进行检测，发现GAPDH和β-actin在死后12d内均有Cq值被检出，且与PMI具有显著的线性关系。之后，任广睦等[26]又用该技术系统分析了大鼠死后12 d内脑组织中GAPDH多个位点片段（5′端到3′端6个片段，GAPDH1～6）的含量与中晚期PMI的关系，发现靠近5′端的3个片段降解速率相近，均快于靠近3′端的3个片段，该研究进一步完善了BAUER等[11]的mRNA死后降解方向的假说，认为可选择更靠近3′端的片段作为晚期PMI推断的指标，并提出了引物序列标准化的想法。

由于自然界中和生物体内均存在大量的RNA酶，以往学者认为RNA的稳定性较差，不适合作为PMI推断的指标。但随着研究的深入，国内外学者逐渐发现死后机体内RNA的降解变化规律具有时序性，可通过测定某些常见的管家基因mRNA（特别是GAPDH和β-actin）的含量变化推断PMI。学者们在2010年前的研究就显示mRNA的时序性降解受到较多因素的影响，如环境温度、湿度、死亡原因、生前影响因素和组织类型等，还有部分学者[11，26]探讨了死后mRNA降解方向的问题，认为mRNA的死后降解是从5′端到3′端，可选取靠近5′端片段作为早期PMI推断的指标，3′端片段作为中晚期PMI推断的指标。另外，也有学者[16]探讨了扩增片段长度对mRNA定量的影响，初步提出了引物序列位置和长度标准化的想法。

运用RNA降解规律推断PMI的定量方法也有明显进步，以往的半定量RT-PCR检测灵敏度相对较低，这也是诸多早期研究[10，17，20，23-24]中同一 mRNA 指标检出时限不同的原因之一，而更为灵敏的qRT-PCR显著推动了该研究领域的进步，是研究死后mRNA时序性变化的可靠工具。但是，和国外研究相比，国内2009年以前的研究材料均为大鼠样本，缺少对其他动物模型和人体样本的探索和验证。此外，虽然国内外相关研究的推断指标主要为管家基因mRNA，特别是GAPDH和β-actin，但由于PMI间隔（或节点）的设置缺少标准，以致早期或中晚期PMI阶段GAPDH和β-actin的时序性变化规律并未得到明确，还需进一步研究。

1.2 近10年运用mRNA死后变化规律推断PMI的研究进展（2010—2019年相关研究）

近10年来，随着RNA研究技术的进步和对RNA（特别是ncRNA）认识的不断提高，单纯运用mRNA死后变化规律推断PMI的相关研究主要集中在2013年前和2017年后，共计23项[27-49]，详见附表1。

1.2.1 运用反转录技术检测mRNA死后变化规律推断PMI的研究进展

在上述23项研究中，运用RT-PCR或qRT-PCR验证单个或多个mRNA指标时序性变化规律进行PMI推断的研究有 15 项[27，31-36，38-41，46-49]。2010 年，PARTEMI等[27]收集了16例人体心肌样本，并分为长PMI组（36～120 h）和短PMI组（0.6～2.7 h），但在4个候选mRNA指标中，只有内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）在两组的表达具有差异。2011年，KIMURA等[31]检测了小鼠和人体3个组织中节律基因的表达情况，分别证实PER2/BMAL1和NR1D1/BMAL1含量比值在24h内呈节律性变化，为PMI推断提供了新思路。2010—2011年，国内学者[28-29，32]也延续了之前的研究[17-22]，在大鼠或小鼠模型中运用RT-PCR或qRT-PCR检测管家基因mRNA的时序性降解规律，但均缺乏对内参指标（内参基因）的考量与筛选。

2013年，SAMPAIO-SILVA等[33]在0～11 h连续取材3种小鼠组织，发现骨骼肌和肝组织中6个mRNA的Cq值均与PMI显著相关，并建立了基于线性回归的数学模型推断早期PMI；该研究的创新之处是预留了额外样本进行验证，验证样本的推断误差在1h左右。同年，YOUNG等[34]尝试使用猪牙髓RNA进行晚期PMI推断，发现较短片段的β-actin在死后84 d内的含量变化与PMI具有相关性。DENG等[35]也做了积极尝试，将DNA作为内参，检测了不同环境温度下缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和β-actin在心脑组织中的时序性变化规律，结果发现，4℃组含量变化不明显，而37℃组各RNA含量在24 h内明显下降。2014年，ZAPICO等[36]研究了细胞死亡蛋白相关基因FsaL和PTEN，发现上述指标在死后6h内表达上升，与PMI有良好的线性关系，但在8h又开始下降。该研究得出了机体死后部分基因转录活性增加和mRNA时序性降解的结论，但时间节点的推论还需进一步证实。

2017年，刘志杰等[38]以次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT）为内参，发现脑组织中核糖体蛋白L32（ribosomal protein L32，RPL32）等指标的相对表达量与PMI存在线性关系。同年，ALI等[39]收集了人体皮肤组织并检测了晚期角质化包膜蛋白1C（late cornified envelope 1C，LCE1C）随 PMI（0～5 d）的变化情况，发现 LCE1C在不同温度组均随PMI延长而逐渐降低。BAI等[40]延续了DENG等[35]的研究，以caspase-3 DNA为内参，证实缺氧相关因子（hypoxia associated factor，HAF）在48h内的表达量随PMI延长而上升，且在0.5～4h有更好的相关性。ELGHAMRY等[41]将大鼠断颈处死后，将尸体分别暴露于空气（30℃）、埋入沙地（30℃）和淹没入水（6℃和30℃）4种环境中长达96h，检测发现脑组织中GAPDH的含量变化和PMI、存放条件及环境温度均密切相关。2018年，FAIS等[46]收集了10例尸检牙龈组织，分为死后1～3d、4～5d和8～9d 3个研究组，并以3例手术牙龈组织为对照，结果发现，尸检组织中HIF-1α的含量随PMI延长而逐渐降低，但死后1～3d和4～5d组中HIF-1α的含量均高于对照组，分析是死亡前的缺氧过程使HIF-1α的表达增加，之后又随PMI延长不断降解。

作为研究RNA表达的精确定量技术，qRT-PCR具有准确高效的优点，但其结果的准确性很大程度上依赖于稳定内参指标的标准化。在上述15项研究中，有11项都使用了内参指标校正，除2项[35，40]使用了DNA进行校正，其余9 项中有5 项[31，36，39，46，49]均使用了 GAPDH或β-actin作为内参指标。但是，KOPPELKAMM等[50]认为，死后机体内理想的内参指标应该较少受PMI、外界环境、组织类型、死亡原因和死前因素的影响，而一般分子生物学研究中常用的GAPDH和β-actin并不满足上述条件，除时序性降解外，GAPDH还被证明在缺氧、窒息条件下表达上调[51-52]，故不适合作为PMI推断研究中的内参指标。鉴于死后组织样本的特殊性，稳定适用的内参指标在一定程度上可以消除个体差异和环境因素的影响，故PMI推断研究的内参指标筛选和验证需要学者进一步关注。当然，在上述研究中，也有部分研究人员[33，47-48]按照实时荧光定量PCR国际化标准暨MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-time PCR Experiments）指南[53]要求，提供了包括样本分析、核酸提取、反转录、靶基因信息、qPCR引物或探针、qPCR实验流程、qPCR合理性验证和数据分析在内的系列实验信息，此举不仅使相关实验操作更加规范，也提升了定量结果的准确性和可重复性。

1.2.2 运用高通量技术检测mRNA死后变化规律推断PMI的研究进展

近几年来，也有学者开始通过生物信息学分析RNA测序数据，在PMI推断研究中取得了一些进展。2015年，FENG等[37]分析了部分基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）数据库 RNA 测序数据，提出mRNA完整性指数（mRNA integrity number，mRIN）的概念，用来评估测序样本中mRNA的降解程度。2017年，ZHU等[42]系统性分析了GTEx数据库中2016个测序样本的基因表达情况，发现PMI相关性基因的整体表达模式具有组织特异性，并筛选出266个差异表达基因，其中206个基因随PMI延长而下调。2018年，FERREIRA等[45]进一步分析了GTEx数据库中36种组织共7105个样本的RNA测序数据，筛选出187个至少在3种组织中都与PMI相关的mRNA指标，并通过梯度提升树建立了数学模型推断PMI，较低推断误差（均值9.45min，中位数63.75min）也证实了多组织、多指标模型的有效性。上述对RNA测序数据分析的研究证实，虽然死后组织内mRNA的表达变化受多种因素（PMI、死亡原因、缺血、窒息等死前状态）影响，但生物信息学分析、大数据工具运用和数学模型创新为运用RNA进行PMI推断提供了一种新的思路和方法。

运用表达谱芯片进行PMI推断的报道也逐年增多。2011年，BIRDSILL等[30]检测了79例人体大脑皮质样本的总RNA，发现RNA完整性指数（RNA integrity number，RIN）与PMI呈负相关，并通过PCR芯片检测了89个基因在早期PMI样本中的表达情况，发现其中65个mRNA指标在机体死后含量逐渐下降，而20个mRNA指标的含量随PMI延长而增加。2017年，HUNTER等[43]和POZHITKOV等[44]运用表达谱芯片检测了斑马鱼和小鼠多个mRNA的表达情况，通过基因计量方法挑选出斑马鱼中548个和小鼠中515个死后表达上调指标，并通过矩阵代数综合多个指标构建数学模型进行PMI推断，额外样本验证结果显示，推断误差在斑马鱼中<3h，在小鼠肝组织中<4h，在小鼠脑组织中<5h。2018年，TAO等[47]通过mRNA表达谱芯片在大鼠心肌中筛选出217个差异表达mRNA指标，其中31个与凋亡、自溶等信号通路有关，特别是细胞分裂周期蛋白25B（cell division cycle protein 25B，CDC25B）与早期PMI的相关性较好，依此建立了多温度数学模型推断PMI，验证结果表明，误差率相对较低（10%左右）。2019年，WANG等[48]延续了TAO等[47]的研究，运用表达谱芯片筛选了一批大鼠脑组织早期PMI相关性mRNA指标，并运用其中6个指标（NINJ2、GRIFIN、ARPP19、HOPX、SYNPR和SYNPO2）建立了多温度数学模型推断PMI，验证结果表明，前4个指标建立的数学模型误差率较低（<3h），通过联用多个数学模型推断PMI，可进一步降低推断误差（<1.5h）。

近几年来，通过分析RNA测序数据和运用高通量芯片技术进行PMI推断的研究中，其共同特点是样本多、组织多、指标多、数据量大，所以需要更加先进的算法（如聚类、矩阵代数、梯度提升树和机器学习等）提供相关支持。在数学模型优化的基础上，验证结果也证实研究所建立的综合性（多组织、多指标）数学模型的推断精度较高，是未来的研究方向之一，但这些研究的缺点是数据处理比较复杂、费用比较昂贵，所以如何应用到实际工作中还需进一步研究。

在2010年前的相关研究中，各学者选择的mRNA指标相对单一，过于依赖前期研究或文献筛选，主要为GAPDH、β-actin等管家基因或EPO、iNOS等单个候选基因，所选用的数学模型也较为简单，仅为线性回归模型，一定程度上也影响了PMI推断的精确性。随着研究的深入，mRNA指标的选择更加多元，在近10年的研究中绝大多数的候选mRNA指标数量超过3个。值得一提的是，指标的筛选也更加依赖转录组学相关技术手段，运用高通量方法（RNA测序或表达谱芯片）筛选与细胞死后变化相关的mRNA（如ARPP19、HPOX和PTEN等）进行PMI推断成为新热点，因其可联合功能学分析，有望阐明特定指标时序性变化的机制，为法医学实践中准确推断PMI提供理论基础。

2 运用ncRNA死后变化规律推断PMI

ncRNA是指不编码蛋白质的RNA，包括转运RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）、核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小 RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）等，上述ncRNA都是细胞生命活动中的重要组成部分，又被称为管家 ncRNA（housekeeping ncRNA）[54]。随着转录组学和生物信息学的发展，尤其是高通量测序技术的广泛应用，更多种类的ncRNA被发现，其调控机制也逐渐被揭示，其在许多重要的生物进程中都发挥着重要的作用，逐渐成为各相关领域研究的热点。其中，常见的具有调控作用的调控ncRNA（regulatory ncRNA）包括微小 RNA（microRNA，miRNA）、长链ncRNA（long ncRNA，lncRNA）和环状 RNA（circular RNA，circRNA）等。

2.1 运用管家ncRNA进行PMI推断的相关研究

运用管家ncRNA死后变化规律推断PMI的研究主要集中在2010年以后。2010年以前用于PMI推断的ncRNA主要是rRNA，且多数研究仅将rRNA作为候选内参指标，或与mRNA的降解规律进行横向对比。

早在1991年，NOGUCHI等[55]比较了大鼠脑组织中精氨酸加压素（arginine vasopressin，AVP）mRNA和18S rRNA的含量，发现死后24h内，AVP的降解速率明显快于18S rRNA。1994年，PARDUE等[56]比较了大鼠脑组织中热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）mRNA和18S rRNA的含量，得出了类似的结论。2007年，刘季等[21]比较了GAPDH和18S rRNA的降解规律，发现18S rRNA降解缓慢，在死后7d仍具有良好的稳定性。上述研究结果均表明，在死亡早期一段时间内，18S rRNA的稳定性高于其他mRNA指标，故其经常被用作内参指标[57-60]或候选内参指标[50，61-62]。2010年，李文灿等[63]提出了不同看法，其发现大鼠心肌组织中18S rRNA的含量在死后96h内逐渐增多，之后才开始下降，推测是18S rRNA存在于核糖核蛋白复合体中，蛋白质时序性降解使rRNA从复合体中释放出来，导致18S rRNA含量在死后一段时间内上升，此报道结果与IWAMOTO等[64]对rRNA不同亚基的研究结果类似，但均需进一步证实。

2011年，朱怡等[58]检测了不同温度小鼠脑组织中βactin和18S rRNA的稳定性，发现β-actin与18S rRNA含量的比值呈时序性下降。同年，VAN DOORN等[59]证实18S rRNA在死后15d的家兔骨髓组织中也可通过qRT-PCR检出。2013年，任广睦等[65]研究了尸检肌肉组织（存放至10d）中不同rRNA亚基（5S rRNA、5.8S rRNA、18 rRNA和28S rRNA）的稳定性，发现各rRNA在死后一定时间内无显著性降解，可作为中晚期PMI推断的内参指标。2015年，尹长玉等[66]延续了上述研究，发现脑组织各亚基的表达量差异仅在0 d和10d具有统计学意义，脾组织各亚基的表达量既和PMI有关，也和年龄有关。2016年，POÓR等[67]完善了YOUNG等[34]的研究，比较了牙髓（放置至121d）中不同片段（800、400和200bp）的β-actin和28S rRNA的含量变化，qRT-PCR结果表明，28S rRNA的检出时间明显长于β-actin，其中200 bp的β-actin可在29 d内检出，而200 bp的28S rRNA可在45 d内检出。同年，姜竹青等[68]证实小鼠肝组织中18S rRNA的死后降解速率随温度升高而加速，并通过插值分析建立了Cq值、PMI和环境温度的多元数学模型进行PMI推断。

2017年，KIM等[69]设计了两个不同位点的28S rRNA片段，一个是5′端片段，一个是包含细胞死亡相关裂解位点（cell death-related cleavage sites）的D8可变区片段，qRT-PCR结果表明，5′端片段在死后心脑组织中均非常稳定，甚至有表达上调趋势，而D8可变区片段含量在死后72h快速下降，两者含量的比值和PMI呈良好的线性关系。上述不同位点的定量结果可在一定程度上解释多个研究中28S rRNA和18S rRNA降解规律不一致的问题，再一次凸显了引物序列标准化的重要性。此外，该研究也用人体尸检脑和肝组织做了验证，发现28S rRNA不同亚基的时序性变化规律依然存在，是理想的PMI推断指标，丰富了运用管家ncRNA进行PMI推断的相关研究。

常见用于PMI推断的rRNA主要为28S rRNA和18S rRNA，相较于mRNA，根据rRNA核糖核蛋白复合体或不同亚基的时序性变化规律进行PMI推断也具有其优势，但还需进一步深入研究。除28S rRNA和18S rRNA外，5S rRNA[70-72]、U6 snRNA[73-75]、RNU6B[72]、snoRNA202[76]和SNORD95[77]等其他ncRNA也常被作为PMI研究的候选内参指标。

2.2 运用调控ncRNA进行PMI推断的相关研究

随着转录组学的快速发展及相关研究技术的进步，包括miRNA、lncRNA和circRNA等在内的多种调控ncRNA的生物学特性和功能被揭示，逐渐成为生物医学领域的研究热点。miRNA是一类只有18～24个核苷酸组成的非编码小RNA，表达具有高度保守性、时序性和组织特异性[78-79]，广泛参与生物体内的各种生理病理过程[80]，是法医学理想的分子标志物。自2009年HANSON等[81]首次将miRNA引入法医学研究以来，其应用逐渐拓展到体液（斑）鉴定（来源和形成时间）[82]、个体年龄推断[83-84]、死亡原因分析[82，85]和 PMI推断等领域。lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的ncRNA，在多种层面上参与蛋白编码基因调控[86]，具有重要的生物学功能，并且在细胞能耗上存在优势。部分lncRNA在死亡早期的改变较mRNA可能更为迅速、灵敏，有望作为早期PMI推断指标。circRNA是2013年以来被重新认识的一类ncRNA[87-90]，其分子呈封闭环状结构，能够耐受核糖核酸酶和核酸外切酶的降解，有更好的稳定性，有望成为中晚期PMI推断的指标或理想的内参指标。

随着对调控ncRNA认识的深入，法医学者们也开始检测各ncRNA在死后组织内的时序性变化规律用于PMI推断。其中，单纯运用某一类RNA进行PMI推断的研究较少，多为联合miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA和其他种类RNA开展多指标分析。近10年的相关研究详见附表2。

2010年，李文灿等[63]发现大鼠心肌组织中miR-1在死后120 h内含量无明显变化，之后才开始下降。2012年，张萍等[73]用geNorm软件[91]分析了死亡早期人体心肌组织中多个RNA指标的稳定性，发现miR-1的稳定性不如U6 snRNA和18S rRNA，但高于管家基因mRNA，提示了内参选择的重要性。2013年，WANG等[74]以U6 snRNA为内参，检测了小鼠肝组织中miR-122、miR-133a、miR-150、miR-195和miR-206在48h内的含量变化，发现上述指标在死后24 h内保持稳定，但miR-133a和miR-206在24h后含量明显下降。

2013年，ODRIOZOLA等[92]尝试使用生物钟节律基因相关miRNA推断PMI，检测了在人体玻璃体液中表达丰度较高的7个miRNA的表达情况，发现各miRNA的含量与PMI无关，但miR-541和miR-142-5p的表达与昼夜节律有关。然而，LECH等[93]在血迹形成时间的研究中发现，miR-541在血液中的表达丰度太低，而miR-142-5p的表达与昼夜节律无关。2015年，CORRADINI等[77]对上述研究进行了完善，检测了U6 snRNA、SNORD95、SNORD61和10个miRNA在血液和玻璃体液中的表达情况，发现SNORD95在两种体液中均表达稳定，适合作为内参指标。该研究也证实，玻璃体液中miR-106b和miR-96、血液中miR-142-5p和miR-219的含量变化与昼夜节律有关，可用于PMI推断，但不足之处是样本量较小。同年，SHARMA等[94]检测了小鼠心脑组织中拮抗凋亡转录因子（apoptosis antagonizing transcription factor，AATF）的RNA组（miR-2909和靶基因AATF mRNA）的死后变化规律，发现AATF mRNA与昼夜节律的相关性高于miR-2909，且两者之间存在协同变化关系，此研究也为PMI推断提供了一种新思路。

上述以miRNA为核心指标的研究在PMI推断领域取得了明显进展，但也存在一些不足，如环境温度设定单一、内参指标选择单一、缺乏组织多样性、数学模型简化及缺乏验证等。针对上述问题，笔者所在的课题 组 于 2014 年以来进 行 了 系列研究[47-48，71，75，95-100]，主要结果有：（1）挑选一批特异性强、死后变化敏感的RNA指标［β-actin、CDC25B和神经损伤诱导蛋白2（nerve injury-induced protein 2，NINJ2）等］，在不同PMI的大鼠和人体多种组织样本中进行批量验证，明确其时序性变化规律（死后24 h内或0～144 h），作为PMI推断的指标；（2）将组织特异性miRNA和5S rRNA等小分子RNA纳入研究，拓展候选内参指标的选择范围，通过联用多种筛选软件，挑选出一些保守性强的小分子RNA作为内参指标进行数据校正，如多组织通用的5S rRNA，脑组织miR-125b、肝组织miR-122和脾组织miR-143等；（3）创新性应用R软件等数学工具在不同组织中建立以RNA表达量、温度和PMI为参数的多元数学模型，有效解决温度因素的影响，并可将人体样本数据进行迭代验证，使模型具有成长性。但是在上述研究中也发现了新问题，相较于中晚期PMI（48～144 h），上述模型在48 h内的推断误差较大，分析原因是指标的筛选力度不足，较为依赖文献报道和前期研究，仍然缺少在死亡早期即发生特异性改变的RNA指标。为此，TAO等[47]和WANG等[48]也尝试使用高通量表达谱芯片旨在筛选一批在死亡早期即敏感变化的RNA指标，以期完善上述系列研究，提高早期PMI推断的准确性。

运用lncRNA和circRNA进行PMI推断的相关研究较少，在过去几年偶有报道。2015年，KRAUS等[101]检测了人不同部位脑组织中90多个lncRNA的表达情况，并筛选出5个在死后14～27 h含量稳定的lncRNA，分别为 LUST、IGF2AS、7SK、HOXA6as和NDM29，可作为PMI推断的内参指标。2018年起，TU等[102-103]以小鼠脑、心肌和肝组织为研究样本，将GAPDH、RPS18、β-actin mRNA和U6 snRNA作为推断指标，将miR-122、miR-133a、LC-Ogdh（同时检测环形和线形产物）和circ-AFF1作为内参指标，建立了死后8 d内的多指标数学模型推断PMI，联合3种组织进行验证，推断误差在0.5d左右。2019年，郝尔娃等[104]检测了小鼠脑组织中CDR1as、Rims2和Dym circRNA的时序性变化规律，结果表明，CDR1as较为稳定，适合作为内参指标，而Rims2和Dym的含量随PMI延长而降低。该研究的不足之处是时间节点设置较少，circRNA指标的死后变化规律亟待明确。

在PMI推断领域，lncRNA和circRNA的研究尚处于起步阶段，而研究较为成熟的miRNA也经常作为内参指标[92，95-99，105]，目前尚缺乏对各调控 ncRNA 整体表达变化规律的研究。与mRNA和其他管家ncRNA相比，调控ncRNA在转录调控中发挥着重要作用，在死亡早期的变化较其他类型的RNA更为敏感、迅速，可作为较早期PMI推断的候选指标。此外，miRNA在死亡原因分析中的应用在近几年也有报道，有望用于不同死亡原因下的PMI推断研究，但都需批量筛选和鉴定。另外，在转录组学快速发展的前提下，下一步的研究可以通过高通量转录组测序或RNA芯片技术，一次性获得死后组织样本中各RNA的表达信息，并通过标准化的生物信息分析流程（差异表达分析、聚类分析和功能富集分析等），明确机体死后一段时间内mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA等的表达谱改变，科学有效地筛选一批候选推断指标。在此基础上，还可通过建立内源竞争性RNA网络，寻找具有对应关系的分子（指标）对或分子（指标）群，如lncRNA-miRNA-mRNA、circRNA-miRNA-mRNA等，阐明死后特异性变化RNA指标的具体调控机制，为PMI的准确推断提供研究基础，使之较少受到各种内外因素的影响。

3 现有问题及展望

虽然国内外学者已做了许多相关研究，但在运用RNA死后降解变化规律推断PMI的实践探索中，还存在着如下问题：（1）虽然研究人员均采用一种或多种实质器官或体液组织开展研究，但多数研究缺乏对各组织中RNA表达丰度的考量，应先筛选表达谱广、表达丰度较高的指标用于下一步分析。（2）由于人体死亡后不同个体间存在着诸如温度、湿度、营养或疾病状态、死亡原因等内外因素的干扰，无法进行系统规律的研究，通过动物模型研究机体死亡后RNA的变化规律对人体PMI推断有着重要的参考价值，但是目前动物模型的设置存在死因单一、环境温度或湿度设定单一以及缺乏人体样本验证的问题，需要进一步完善。（3）qRT-PCR作为快速高效的RNA定量技术，在PMI推断相关研究领域得到广泛应用，但由于该方法得到的结果依赖内参指标的标准化，因此内参指标的筛选和验证应该得到足够重视，笔者建议使用内参筛选工具 geNorm[91]、NormFinder[106]、BestKeeper[107]、RefFinder[107]等，并筛选出两个及以上的内参指标，继而分析内参指标和各影响因素的关系；此外，qRTPCR实验流程应严格按照MIQE指南进行，以提高结果的准确性和可重复性。（4）现有推断指标还是以管家基因mRNA为主，而内参指标以小分子ncRNA为主，但两者的研究方式并不完全一致，研究者在联合使用时应引起重视。（5）用于PMI推断的RNA指标筛选力度依然不足，寻找在死亡早期即敏感变化的RNA指标，或寻找在死后一段时间内保持稳定、之后持续变化的RNA指标依然是今后研究的重点，借助高通量测序或芯片进行批量筛选或是可行的方式。（6）目前研究缺乏RNA指标的功能性分析，在未来的研究中可适当筛选并验证细胞死亡相关的指标，并通过细胞或分子实验阐明其死后的表达变化机制，为运用RNA推断PMI提供理论基础。（7）多方法、多组学（转录组学及其相关的基因组学、蛋白组学、代谢组学和微生物组学等）联用较少，机体死后各种时序性变化是一个有机整体，多方法或者多组学联用有望综合发挥作用，提升PMI推断的精确性。（8）多数研究的数学工具较为简单，建立的PMI推断模型缺乏成长性，而日益兴起的人工智能算法有望为PMI推断提供足够的技术支撑。

本文以文献报道时间（2010年以前/以后）和RNA类型（管家/调控）为主线，分别综述了运用mRNA和ncRNA进行PMI推断的系列研究。相较于其他推断方法，运用RNA特异性变化规律推断PMI具有一定优势（如组织特异性、种类丰富、表达迅速、相对稳定、具有日夜节律等），但也存在一些局限（费用昂贵、实验条件要求高、流程相对繁琐等）。因此，现有多数研究仍停留在实验室阶段，但也有学者尝试提出标准化的实验流程，并以创建试剂盒的方式使之应用于实践，然而还需进一步探索。另外，单纯运用mRNA或者某种ncRNA开展研究也具有一定的局限性，寻找具有对应关系的指标对或群具有其应用前景。制约PMI推断精确性的重要因素包括环境因素和个体差异，因此，方法技术的革新（一步法qRT-PCR、数字PCR、多内参指标、机器学习方法、具有成长性的数学模型）和批量人体样本的验证都至关重要。此外，通过细胞或分子实验寻找具有对应关系的指标对或群，也是未来研究的趋势，在转录组学的基础上结合多组学分析，有望能够提升PMI推断的精确性。