土壤微生物群落结构研究方法＊

黄潇，赵智勇，蔡颖慧

土壤微生物群落结构研究方法＊

黄潇1，赵智勇1，蔡颖慧2

（1.山西省分析科学研究院，山西 太原 030006；2.山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030006）

对土壤微生物群落结构研究方法进行了综述，主要有生物化学研究方法和分析生物学研究方法两大类。生化法研究土壤微生物群落结构的方法主要包括微生物平板记数法、底物利用分析法、生物标记法。土壤微生物在基因水平上的群落结构研究可以用核酸杂交技术、DNA成分多态性图谱分析、DNA长度多态性图谱分析、土壤宏基因组学、高通量测序技术等进行研究。目前，分子生物学、基因技术已在微生物群落结构研究中获得了很大关注，高通量测序技术和基因组学技术也得到了更广泛的应用。综上所述，每个方法都有各自的有优缺点，在实际选取时需要结合实际情况。

土壤；微生物群落结构；研究方法；分子生物学

1 前言

土壤微生物维持着土壤物质循环和生态平衡，在植物养分转换中起着重要的作用，是土壤生态系统的重要组分。土壤微生物的群落结构对土壤生态系统有很大影响，在调节土壤生态系统、环境治理和资源可持续利用方面具有重要意义。研究土壤微生物多样性的方法有生物化学成分分析法和现代分子水平分析法两大类。对土壤微生物群落结构的研究涉及多学科领域，如土壤学、微生物学及生态学等。该项研究对应对全球气候变化、各类环境污染治理及维持生态功能等方面有重要意义。

2 土壤微生物群落结构的生化研究方法

生物化学法以生化角度为依据，主要包括平板记数法、底物利用分析法、生物标记法3种。

2.1 平板技术——培养鉴定法

此法用平板对细胞进行分离培养，后依据微生物菌落的数量和菌落的形态特征来判定微生物的数量及类型。该方法速度快，但无法重复土壤真实的生物指标，培养获得的微生物数量远远小于实际微生物数量，甚至不足1%，该方法有一定的限制性和片面性，已逐渐被其他方法所替代[1]。

2.2 底物利用分析法

底物利用分析，主要有Biolog法，利用不同土壤微生物所需的碳源形式不同，比较鉴定微生物群落结构。谭兆赞等人用Biolog法分析了土壤微生物中的特征碳源，结果表明特征碳源对土壤微生物群落结构的变化更敏感。Biolog碳素利用法再现土壤微生物群落的原代谢特征，且灵敏度高、简单快速、自动化程度高，但仅限于检测可培养、能迅速生长的微生物[2]。

2.3 生物标记法

生物标记法中常用的主要有磷脂脂肪酸（PLFA）分析法，磷脂脂肪酸在活细胞中的含量相对恒定，但在死亡的细胞中会迅速分解。PLFA分析技术由WHITE首次提出，常用于计算总生物量。2004年，TOMOYOSHI等人发现了大米土壤中细菌群落多样性和PLFA量呈比例关系。PLFA分析技术已被应用于对森林土壤、植物根际土壤、火灾迹地土壤、植物入侵地土壤等微生物多样性的研究方面[3]。PLFA分析法具有以下优点：能直接有效地提供微生物群落中的信息；对细胞生理活性没有特殊的要求；不受质粒损失或增加的影响，实验结果更为可靠。该方法经过不断发展完善，目前多采用GC-MS方法，较为准确、快捷。

3 土壤微生物群落结构的分子生物学研究方法

随着微生物研究技术的发展，尤其是分子生物学技术被广泛运用，为生物多样性研究提供了新的分析方法，丰富了土壤微生物结构研究方法。

3.1 核酸杂交技术

根据已知的核酸探针与待测样品中的核酸序列形成特异性互补的原理，通过对杂交信号的荧光标记取代同位素标记的检测分析，得到土壤微生物群落结构特征[4]。荧光原位杂交（FISH）技术已应用于土壤微生物群落结构检测方面，它具有简便快速、灵敏度高、探针保存期长等优点。

3.2 DNA成分多态性图谱分析

DNA成分多态性图谱分析，主要有DGGE和TGGE，即变性剂浓度梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳。DGGE应用最为广泛，主要原理是：长度相同而序列不同的DNA片段有不同的解链行为，凝胶分离后停留在不同的位置，能将同样大小的DNA片段很理想地分开。TGGE则是利用温度梯度变性的原理，对不同核苷酸片段进行分离与分析。 DGGE一般包括三个步骤：核酸提取，16SrRNA序列PCR扩增和指纹图谱分析。DGGE和TGGE是很有用的分子标记方法，具有方便、结果分辨率高等特点，在分子微生物生态学研究中得到广泛使用。张平究等人用DGGE方法研究了长期不同施肥条件下水稻土中微生物群落结构的变化[5]。

3.3 DNA长度多态性图谱分析

DNA长度多态性图谱分析最常用的是RFLP和T-RFLP法，即限制性片段长度多态性技术和末端限制性片段长度多态技术。RFLP法，是一种依据DNA多态性研究微生物多样性的方法。方法程序为：用限制性内切酶酶切提取的DNA，后用凝胶电泳分开DNA片段，再把DNA片段转移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）。王英等人用RFLP技术对免耕水稻土壤中细菌的多样性和空间分布研究发现，细菌种类非常丰富，而且在不同层的土壤中存在空间差异性。T-RFLP技术与RFLP的原理相同，区别在于标记引物不同。T-RFLP是一种高效可重复的技术，它可以对一个生物群体的特定基因进行定性和定量测定，弥补了RFLP技术的局限性，简化了图谱，并且更准确地反映土壤微生物群落结构。DING等人采用T-RFLP技术研究了植物内生细菌的多样性和动态变化。BARRETO等人用T-RFLP技术研究热带湖泊沉积物中，细菌、古细菌和产甲烷古菌的空间分布规律。该法优点是不需要纯培养菌株，方法效率高、特异性强；缺点和局限性主要是假末端限制性片段的形成，可能导致对微生物多样性的过多估计，引物和限制酶的选择也是很重要的。

3.4 土壤宏基因组学

宏基因组学（Metagenomics）主要含义是：以特定环境中全部微生物的总DNA作为研究对象，着眼于功能基因的挑选，研究微生物群落结构演化关系及与环境之间的相互关系，不依赖于微生物的分离与培养，因而减少了由此带来的瓶颈问题。该方法是1998年由HANDELSMAN等人首次提出的，对土壤微生物的丰度和种类进行了系统化研究，并构建16SrRNA基因文库。优点是能更好地研究那些不能被分离培养的微生物，并通过整个群落环境及个体间相互影响，发现微生物群落共存特性。2014年，SMEDILE等人利用宏基因组学研究了地中海深海高盐缺氧盆地的微生物系。2016年，南京农大基于Illumina的16SrRNA测序方法研究表明人参果的种植增加了喀斯特地区细菌群落的多样性和丰度。

3.5 高通量测序技术

高通量测序技术，是近几年发展起来的测序技术，主要分为三代。Sanger测序法，即双脱氧核苷酸终止法是第1代高通量测序技术。方法流程为：样本准备、文库构建、测序反应及数据分析。第2代测序技术，主要指3个高通量测序平台，主要包括Illumina 公司的Solexa合成测序平台、Roche公司的454焦磷酸测序平台和ABI的SOLiD连接法测序平台。此技术可以检测到低丰度微生物群落，且分析准确性得到很大提高。以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术，依据荧光标记的脱氧核苷酸、纳米微孔和共聚焦显微镜这3个关键技术，短时间可以读取几千个碱基，且准确度高于99.99%，主要有太平洋生物科学（Pacific Biosciences）公司推出的单分子实时DNA测序技术（Single Molecule Real Time，SMRT）、牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies Ltd）的纳米孔单分子测序技术和生物科学（BioScience）公司的HeliScope单分子测序仪[6]。高通量测序技术现已作为研究土壤微生物群落结构的方法被广泛关注。

4 小结与展望

从生物化学成分分析到现代分子生物学，每一种分析方法都能从一个角度揭示土壤微生物群落结构的特征，优缺点共存，同时也存在着一定的局限性。随着生物信息学技术的发展成熟和实验成本下降，高通量测序、宏基因组学会被更加广泛关注和应用。综上所述，每个方法都有各自的优缺点，在实际应用中需要结合实际情况做出选择，在研究中尽可能获得更为全面准确的信息，甚至建立全方法信息库，或许是今后土壤微生物群落结构研究的趋势。

［1］刘国华，叶正芳，吴为中.土壤微生物群落多样性解析法：从培养到非培［J］.生态学报，2014，32（14）：4421-4433.

［2］朱菲莹，肖姬玲，张屹，等.土壤微生物群落结构研究方法综述［J］.湖南农业科学，2017（10）：112-115.

［3］刘摇微，王树涛，陈英旭.转Bt基因水稻根际土壤微生物多样性的磷脂脂肪酸（PLFAs）表征［J］.应用生态学报，2011，22（3）：727-733.

［4］钟文辉，王薇，林先贵，等.核酸分析方法在土壤微生物多样性研究中的应用［J］.土壤学报，2009，46（2）：334-341.

［5］蔡晨秋，唐丽，龙春林，等.土壤微生物多样性及其研究方法综述［J］.安徽农业科学，2011，39（28）：17274-17278.

［6］李洁，李睿玉，杨红，等.土壤微生物多样性的研究方法［J］.山西农业科学，2016，44（11）：1738-1742，1746.

S154.3

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.12.014

2095－6835（2020）12－0036－02

山西省青年科技研究基金项目（编号：201601D202088）

黄潇（1984—），女，硕士，副研究员，研究方向为微生物学。

蔡颖慧。

〔编辑：严丽琴〕