腺相关病毒载体在基因治疗领域中的应用和挑战

谭靓，李泰明

腺相关病毒载体在基因治疗领域中的应用和挑战

谭靓，李泰明

（中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏 南京 210009）

腺相关病毒载体是基因治疗领域中最有前景的基因递送平台之一，它具有免疫原性较低、安全性高、制备简单、可大规模生产等优势，尤其在安全性方面远超其他病毒载体。近几年，在难治性疾病的临床治疗中，腺相关病毒基因载体发挥着越来越重要的作用，但由于仍存在一些待解决的问题，尚未在临床中大规模应用。综述了目前腺相关病毒基因载体在基因治疗领域中的应用趋势和所面对的挑战，并进行了展望。

基因治疗；腺相关病毒载体；基因递送；表达效率

1 前言

腺相关病毒（Adeno-associated viruse，AAV）载体是以AAV基因组为骨架改造而来的基因递送工具。腺相关病毒属于细小病毒科的低致病性病毒，它的基因组为线性单链DNA，大小约4.7 kB，在基因组两端分别有一条反向末端重复序列（Inverted terminal repeat，ITR），其中的D序列与病毒基因组高效释放、选择性复制和包装密切相关，基因组编码区有2个开放阅读框，分别编码4种Rep蛋白和3种Cap蛋白，它们分别在基因组复制、病毒装配以及包装中发挥着作用[1]。在设计AAV载体基因组时，需要将编码区基因序列替换为目的基因和相关功能片段，仅保留两端反向末端重复序列。在其生产时采用三质粒共转染法，即将带有AAV载体基因组的质粒、腺病毒辅助基因质粒、表达cap和rep蛋白的质粒共转染细胞。

AAV按血清试验结果可以分为不同种，目前已有13种AAV血清型（AAV1～AAV13），分别靶向不同的受体和组织。在制备腺相关病毒载体时，通常根据疾病部位和靶向组织的不同，选择不同的血清型。具体受体及靶向目标如表1所示[2]。

与慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体等其他常用病毒载体相比，AAV载体在没有辅助病毒的情况下并不发生产毒性感染，具有高安全性、低免疫原性、宿主细胞范围广（感染分裂和非分裂细胞）、易生产、高穿透性、长时表达、定点整合等优点，在基因治疗领域具有极大的应用前景[3]。

2 腺相关病毒基因载体在基因治疗中的应用

2.1 使用腺相关病毒基因载体介导基因置换

基因置换指通过使用特定方法，将治疗性基因递送入指定细胞，利用染色体同源重组原理置换掉功能失常的基因。此技术适用于治疗隐性单基因遗传病，并在临床上取得了最大的成功，例如Luxturna，它是以AAV2为载体的基因治疗药物，通过眼部注射，递送RPE65基因表达框治疗由双等位基因突变引起的视网膜营养不良[4]。在2000年早期，从灵长类动物中发现的一个新的AAV血清型及突变体，使AAV载体药物在血管注射后的转基因传递更为广泛[5]。并且，一些AAV基因置换临床试验通过替换此衣壳取得了较好的治疗效果，例如治疗A/B型血友病、治疗杜氏肌营养不良症等。

表1 不同血清型AAV的受体及靶向目标

AAV靶向受体靶向目标 AAV1唾液酸肌肉、脑、眼、胰腺 AAV2硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，层黏连蛋白受体肾 AAV3硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，层黏连蛋白受体肝肿瘤 AAV4唾液酸肺、肾、脑、眼 AAV5唾液酸肺、脑、眼 AAV6唾液酸硫酸，乙酰肝素蛋白聚糖心脏、肌肉、肺 AAV7未知肌肉、眼 AAV8层黏连蛋白受体肌肉、脑、眼、胰腺、肝 AAV9半乳糖，层黏连蛋白受体肌肉、脑、眼、胰腺、肾、心脏、肺 AAV10未知脑、新生组织、小肠、结肠 AAV11未知未知 AAV12未知鼻腔 AAV13硫酸乙酰肝素蛋白聚糖未知

2.2 使用腺相关病毒基因载体介导基因编辑

利用基因编辑技术可以直接修复人体内潜在的疾病基因，它通常包括两个步骤：引起基因组靶向DNA断裂；进行DNA修复实现基因组改变。CRISPR-Cas9是十分重要的基因编辑技术，能够通过向导RNA的设计，实现靶向基因组DNA位点的精确定位，并且设计简单，易操作，成为目前科学研究和临床应用的热点。与腺病毒、慢病毒等相比，AAV作为一种免疫原性较低的病毒载体，十分适用于CRISPR-Cas9系统的递送，并且由于其宿主基因组整合率较低，不会引起CRISPR-Cas9在体内的长期表达，降低了基因编辑脱靶突变概率和致癌风险。除此之外，AAV载体也可以参与DNA修复过程，递送具有靶序列同源重组臂和治疗基因序列的基因组[6]，最终通过与Cas9蛋白编码基因同时递送，实现基因治疗。

2.3 使用腺相关病毒基因载体介导基因沉默

基因沉默技术主要用于治疗由获得毒性突变引起的单基因疾病。其中，由AAV载体介导的CRISPR-Cas9基因编辑技术单独使用也可以从mRNA水平实现高特异性的基因沉默[7]。然而，RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术目前占据了rAAV基因沉默平台的主导地位，它是mRNA水平调控的重要机制。shRNA在用基因沉默技术时，存在基因沉默脱靶的可能。使用Pol III启动时，高表达的shRNA可能会影响内源性miRNA的生成途径，引起细胞毒性[8]。并且，AAV载体在递送编码shRNA的基因DNA序列时，载体基因组可能会因为DNA序列的短发卡结构而被截断，使基因组的同源性受影响[9]。然而，使用AAV载体递送编码siRNA的工程化pre-miR-33可以解决上述问题，基因沉默脱靶概率和细胞毒性被降低，并且基因沉默效率与shRNA不相上下[10]。

3 腺相关病毒基因载体在基因治疗中的挑战

3.1 待优化的病毒包装系统

AAV病毒最常用的两个包装系统为哺乳动物人胚胎肾细胞293（HEK29）包装系统和杆状病毒/Sf9系统。其中，杆状病毒/Sf9系统是最早使用的包装系统之一，可用于生产多种表型的AAV病毒，此系统的包装成本较低，但病毒衣壳组分极易发生改变、生物效价较差。另外，由于包装时衣壳基因辅助质粒使用的VP1起始密码子为非经典的ACG，使得此系统包装的AAV病毒感染效率较差[11]。然而，考虑到大规模生产的成本问题，杆状病毒/Sf9系统更适合应用于商业生产中。为了解决其存在的问题，有团队尝试对VP1起始密码子进行替换，但此方法缺乏不同血清型AAV生产所必需的灵活性。ZOLOTUKHIN等人通过筛选效果较弱的KOZAK序列，改变了核糖体扫描起始位点，建立了能够包装多种AAV血清型的昆虫包装系统，此系统与哺乳细胞包装系统相比，病毒VP1和VP2蛋白含量大大增加，并且包装的AAV5病毒 DNA污染率更低、生物效价更优、在小鼠大脑组织中的转导效率更好[12]。除了对于包装系统的优化外，衣壳蛋白表达单元的设计对于组装有效的基因治疗载体也至关重要[13]。

3.2 有限的基因组表达效率

应用腺相关病毒载体时发现，它的基因组在核内表达效率十分有限，并且对于某些难转型细胞，其介导的基因转导较低，而这可能与其胞内运输和核内活动有关。据研究报道，细胞中存在一种伴侣蛋白FKBP52，它会在细胞表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的作用下，发生酪氨酸或苏氨酸/丝氨酸磷酸化，在AAV介导外源基因胞内运输时，磷酸化的FKBP52能使其衣壳表面的酪氨酸残基磷酸化，衣壳蛋白泛素化水平因此提高，被蛋白酶体识别和降解的概率大大提高，最终外源基因表达效率受到抑制，并且，在细胞核中，磷酸化的FKBP52会与AAV载体基因组3’端的D序列结合，阻碍基因组第二条链的合成，从而降低AAV载体介导的基因表达效率[14]。此外，低效率的内含体-溶酶体逃逸过程也可能阻碍其顺利完成胞内运输过程，阻碍基因表达。

3.3 高昂的治疗费用

尽管AAV载体药物在治疗某些罕见疾病方面取得了卓越的科学成就，但它的大规模临床使用和商业开发仍面临极大挑战。其中，由于目前AAV病毒包装系统仍未最优化，并且有限的基因表达效率增大了前期研究和临床治疗中病毒滴度的使用量，使基因治疗中AAV载体药物的价格十分高昂。例如，世界上首个基因治疗药物Glybera。它被用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏[15]，由于其高昂的治疗费用和较少的市场需求，在欧盟上市期间仅有一名患者接受治疗，使其成为历史上使用者最少的药物之一，最终被宣布退出市场[16]。因此，实现AAV载体药物广泛使用需要调整治疗费用和增加患者普及率。然而，这一目标的实现需要有扎实的科研成果支持，因此，提高AAV载体的包装效率、转导效率和基因表达效率是解决问题的关键。

4 展望

基因治疗是人类治疗肿瘤、传染病、遗传病的新方向。与传统治疗方法相比，它可对疾病进行治疗，从根本上起到预防、缓解，甚至根治疾病的作用。AAV载体作为一种低免疫原性的病毒载体，在安全性方面优于其他病毒载体，是目前基因治疗领域的研究热点，并且已开始应用于一些疾病的临床治疗中。

但AAV载体在某些细胞中的转导效率和基因表达效率仍有待提高。并且，要实现腺相关病毒载体药物的广泛使用，还要解决载体的大规模生产问题。然而，随着人类对AAV研究的深入，其基因组特点和感染机制以及胞内过程越来越清晰，基于此的基因组改造和载体优化越来越成熟，相信在不久的将来，会有越来越多高安全性和兼备有效性的AAV药物在临床上市，服务于更多有需要的人群。

［1］WEITZMAN M D，LINDEN R M.Adeno-associated virus biology［J］.Methods in Molecular Biology，2011（807）：1-23.

［2］HUANG L Y，HALDER S，AGBANDJE-MCKENNA M.Parvovirus glycan interactions［J］.Current Opinion in Virology，2014（7）：108-118.

［3］CHATTERJEE S，WONG K K.Adeno-associated virus vectors for gene therapy of the hematopoietic system［J］. Current Topics in Microbiology and Immunology，1996（218）：61-73.

［4］RUSSELL S，BENNETT J，WELLMAN J A，et al.Efficacy and safety of voretigene neparvovec（AAV2-hRPE65v2） in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy：a randomised，controlled，open-label，phase 3 trial［J］.Lancet，2017，390（10097）：849-860.

［5］GAO G，VANDEMBERGHE L H，ALVIRA M R，et al.Clades of adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues［J］.J Virol，2004，78（12）：6381-6388.

［6］YANG Y，WANG L L，BELL P，et al.A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice［J］.Nat Biotechnol，2016，34（3）：334.

［7］ABUDAYYEH O O，GOOTENBERG J S，ESSLETZBICHLER P，et al.RNA targeting with CRISPR-Cas13［J］.Nature，2017，550（7675）：280.

［8］GRIMM D，STREETZ K L，JOPLING C L，et al.Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways［J］.Nature，2006，441（7092）：537-541.

［9］XIE J，MAO Q，TAI P W L，et al.Short DNA hairpins compromise recombinant adeno-associated virus genome homogeneity［J］.Mol Ther，2017，25（6）：1363-1374.

［10］XIE J，TAI PWL，BROWN A，et al.A novel rAAV-amiRNA platform enables potent in vivo gene silencing and a ten-fold enhancement of on-target specificity over conventional shRNA vectors［J］.Mol Ther，2018，26（5）：436-437.

［11］ASLANIDI G，LAMB K，ZOLOTUKHIN S.An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus （rAAV） vectors in insect Sf9 cells［J］.P Natl Acad Sci USA，2009，106（13）：5059-5064.

［12］KONRATOV O，MARSIC D，CROSSON SM，et al.Direct head-to-head evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors manufactured in human versus insect cells［J］.Mol Ther，2017，25（12）：2661-2675.

［13］SNIJDER J，WATERBEEMD M，DAMOC E，et al.Defining the stoichiometry and cargo Load of viral and bacterial nanoparticles by orbitrap mass spectrometry［J］.J Am Chem Soc，2014，136（20）：7295-7299.

［14］ZHONG L，LI B，MAH C S，et al.Next generation of adeno-associated virus 2 vectors：point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（22）：7827-7832.

［15］BURNETT J R，HOOPER A J，ALIPOGENE T.An adeno-associated virus encoding the Ser（447）X variant of the human lipoprotein lipase gene for the treatment of patients with lipoprotein lipase deficiency［J］.Current Opinion in Molecular Therapeutics，2009，11（6）：681-691.

［16］YLA-HERTTUALA S.Bumps in the road for commercial gene therapy for rare diseases［J］.Mol Ther，2017，25（10）：2225.

R450

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.13.066

2095－6835（2020）13－0157－03

谭靓（1995—），女，湖南衡阳人，研究生，研究方向为生物制药、基因治疗。

李泰明（1963—），女，江苏南京人，博士，副教授，研究方向为生物制药。

〔编辑：严丽琴〕