外源褪黑素处理对鲜切芒果贮藏品质的影响

刘帅民，胡康琦，刘港帅，张善英，潘永贵，史学群，张正科,*

（1.海南大学食品科学与工程学院，海南 海口 570228；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

芒果（Mangifera indicaL.）是一种具有极高营养价值的热带水果，因富含碳水化合物、矿物质、膳食纤维、维生素和多酚等成分而深受大众喜爱[1-2]。经过分级、清洗、去皮、去核、切块或切片、包装等处理以得到方便即食的水果或蔬菜称为鲜切果蔬[3]，鲜切加工的芒果由于其新鲜、方便快捷、可食率高等特点，日益受到国内外消费者青睐。然而，鲜切容易造成果肉组织代谢过程发生紊乱，进而造成果肉发生褐变以及腐败变质[4]；因此急需探寻适宜的保鲜方式以延长鲜切芒果的货架期。目前，国内外有关维持鲜切芒果品质的研究主要集中在控制采收期和成熟度[5]、热处理[6-7]、可食性涂膜[8]、果蔬保鲜剂[4,7,9-10]、脉冲光处理[9,11]等应用技术方面。其中，采用安全性较高的保鲜剂是最为常见的鲜切芒果保鲜方法之一。目前已有柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、钙盐等在鲜切芒果中的应用报道，但是仍存在保鲜效果不稳定、易改变果实风味等问题。

褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺）是一种具有较强生物活性的天然物质，广泛存在于动植物体中[12]。在高等植物中，褪黑素被证实是一种类似于植物激素的信号分子，参与多个生理过程的调控，例如种子萌发、开花、昼夜节律、光合作用、成熟和衰老以及对环境胁迫的响应等[13]。近年来，褪黑素在果蔬采后贮藏保鲜方面的应用受到了广泛关注。用褪黑素处理采后桃果实可抑制其质量损失及呼吸作用，增强果实抗氧化活性，从而有效减缓果实品质下降[14]；褪黑素还可通过增强抗氧化活性和提高氧化损伤修复能力来延缓采后荔枝果实在贮藏期间的快速褐变，延长其货架期[15]；褪黑素处理可增加草莓果实总酚（total phenolics，TP）和类黄酮含量，继而提高果实抗氧化能力，维持其较好的贮藏品质[16]；此外，褪黑素处理还可抑制采后香蕉[17]和梨[18]果实在贮藏期间的乙烯生物合成，故能延缓果实的成熟衰老及品质劣变。这些研究表明，褪黑素作为一种新型、天然、安全的保鲜剂，能够有效维持果蔬的采后品质，具有较好的应用前景。然而，将褪黑素应用于鲜切芒果的保鲜研究尚鲜见报道。

本实验研究了外源褪黑素喷洒处理对鲜切芒果贮藏过程中品质变化的影响，旨在明确褪黑素对鲜切芒果的作用效果及其相关生理机制，为褪黑素在鲜切水果中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试‘贵妃’芒果采摘于三亚崖州（109°18′E、18°33′N），果实运抵实验室后进行分级和清洗，自然晾干后选择颜色、形状、大小一致的果实置于室温条件（（20±1）℃、相对湿度（85±5）%）贮藏，待果实成熟至可食用期后进行切分。

褪黑素（分析纯） 上海源叶生物科技有限公司；β-胡萝卜素、抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）、乙腈、甲醇、四氢呋喃 上海阿拉丁试剂有限公司；没食子酸、芦丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、柠檬酸 北京索莱宝科技有限公司；其他所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FT-02型硬度计 意大利Breuzzi公司；手持式折射仪 日本Atago公司；CR-400色差仪 日本Konica Minolta公司；T18数字高速均质机 德国IKA集团；CR22N落地式高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；1260高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC） 美国安捷伦科技有限公司；T6新世纪紫外-可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

将达到可食用期的芒果（硬度25 N、可溶性固形物质量分数（soluble solid content，SSC）13%、总可滴定酸（total titratable acidity，TTA）质量分数0.3%左右）随机分成2 组，每组99 个。将果实削皮后切块，并将每3 个果实的12 个切块（从每个芒果切出的切块中选择4 块2 cm×2 cm×2 cm的切块）分装在一个一次性聚丙烯保鲜盒（135 mm×90 mm×40 mm，塑料盒上含16 个直径6 mm的小孔）中，每盒果实代表1 个生物学重复。将褪黑素溶解于蒸馏水配制成浓度为0.5 mmol/L的溶液（该浓度经预实验筛选获得）。在每个芒果块上均匀喷洒褪黑素溶液，对照组喷洒相同量的蒸馏水，自然晾干后置于（15±1）℃、相对湿度（85±5）%条件下贮藏4 d。贮藏期间，每日各取3 盒处理组和对照组的果实切块进行果肉色泽、硬度、SSC、TTA质量分数和固酸比测定。与此同时，每日各取3 盒处理组和对照组的果实切块进行果肉取样，用液氮快速冷冻、捣碎，贮存在-40 ℃冰箱中待测其他生化指标。

1.3.2 感官品质指标测定

使用色差仪进行果肉颜色测定，数值基于CIE系统以L*、a*、b*值表示，其中L*值表示亮度、a*值代表红/绿度、b*值代表蓝/黄度。

使用FT-02型硬度计（探头直径为6 mm）测定硬度。对于SSC测量，取10 g果肉组织匀浆，在8 000×g 条件下离心15 min，上清液用手持折射仪测定其SSC，单位为%。将上述上清液（2 mL）用18 mL蒸馏水稀释，然后用0.01 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.1，TTA质量分数以芒果中的柠檬酸质量分数表示。固酸比为SSC与TA的比值。

1.3.3 营养品质指标测定

β-胡萝卜素含量测定参照Shivashankara等[19]的方法并略作修改。通过HPLC进行分析，配备分析柱Zorbax SB-Aq-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），进样量10 μL，流动相为甲醇和乙酸乙酯（5 0∶5 0，V/V），平衡10 min，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃。通过可变波长扫描紫外检测器在449 nm波长处测定吸光度，β-胡萝卜素含量通过标准品绘制的标准曲线进行计算，单位为mg/kg，结果以鲜质量计。

AsA含量测定参照Gonzalez-Aguilar等[20]的方法并略作修改，将果肉组织（2 g）于100 mL含30 g/L的偏磷酸和80 mL/L的乙酸溶液中匀浆。将匀浆在8 750×g、4 ℃条件下离心15 min，之后将上清液通过0.22 μm膜过滤器并注入高效液相色谱仪。检测波长为245 nm，进样量10 μL，流速为1.0 mL/min；使用Zorbax SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）作为固定相，流动相为体积分数0.25%的偏磷酸溶液（pH 2.55）。AsA含量的单位为mg/kg，结果以鲜质量计。

1.3.4 TP和类黄酮含量测定

TP含量测定采用福林-酚法[21]。用没食子酸制作标准曲线，单位为mg/kg。类黄酮提取和测定参照林毅雄等[22]的方法。用芦丁绘制标准曲线计算类黄酮类含量，类黄酮含量表示为mg/kg。以上结果均以鲜质量计。

1.3.5 多酚氧化酶和过氧化物酶活力测定

按照Zhang Zhengke等[23]的方法，取5 g果肉组织于40 mL 50 mmol/L的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（含5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），pH 7.0）中匀浆得到酶提取液。测定多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活力时，分别以1 mL 0.5 mol/L邻苯二酚和1 mL 0.5 mol/L愈创木酚为底物，加入0.5 mL酶提取液启动反应后分别在420、470 nm波长处分别测定吸光度。以每毫克蛋白每分钟吸光度变化0.01为1 个酶活力单位（U），PPO和POD活力均表示为U/mg。

1.3.6 O2-·产生速率和·OH产生量测定

冷冻果肉（2 g）加入10 mL 65 mmol/L PBS（pH 6.8）匀浆，之后将匀浆液在4 ℃、5 000×g离心15 min，得到上清液，取上清液测定O2-·产生速率和·OH产生量。O2-·产生速率测定采用Gao Hui等[14]的方法，用NaNO2制作标准曲线，O2-·产生速率以每千克鲜果肉每分钟产生的NaNO2质量表示，单位为nmol/（g·min）。·OH产生量测定参照张乃东等[24]的方法，取上清液1 mL，转移至含有1 mL 0.025 mol/L的[F e（p h e n）3]2-（1.4 8 5 g 一水合邻菲啰啉、0.695 g FeSO4·7H2O溶于100 mL蒸馏水中配制而成）和1 mL蒸馏水的试管中。以蒸馏水调零，测定溶液在420 nm波长处的吸光度（A1），以蒸馏水代替上清液测定的吸光度为A0。·OH产生量以ΔA表征，其中ΔA＝A0-A1。

1.3.7 总抗氧化活性测定

取2 g果肉在20 mL含有0.5 g/L的偏亚硫酸氢钠的甲醇中匀浆，之后在4 ℃、4 000×g条件下离心20 min制备甲醇提取液。

参照Zhang Zhengke等[23]的方法测定总抗氧化活性，将1 mL甲醇提取液与3 mL含0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液混匀后在25 ℃条件下于黑暗中孵育30 min，在517 nm波长处测定样品吸光度。对照以甲醇代替甲醇提取液、空白以甲醇代替DPPH溶液测定吸光度。DPPH自由基清除率按下式进行计算。

还原力测定根据Fan Panhui等[25]的方法，将0.2 mL上述甲醇提取物与2.5 mL 0.2 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 6.6）混合，然后加入2.5 mL 1 g/L铁氰化钾溶液反应，之后将3 mL反应液以蒸馏水做空白在700 nm波长处测定吸光度，记录为A0，以甲醇代替甲醇提取液在同等反应条件下测定吸光度，记录为A1，还原力用ΔA表征，其中ΔA＝A0-A1表示。

1.4 数据统计与分析

用SPSS软件对数据进行单因素方差分析，比较处理组与对照组差异的显著性。用Sigmaplot 14.0软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对鲜切芒果感官品质的影响

图1 褪黑素处理对鲜切芒果果肉色泽的影响Fig. 1 Effect of melatonin treatment on the color of fresh cut mango pulp

由图1可知，在整个贮藏期间，对照组和褪黑素处理组果肉色度L*值和b*值持续下降，a*值则呈现不断上升趋势。L*值可以直观地反映果实在贮藏过程中果肉的光泽度[26]。从第1天开始，对照组果肉L*值显著或极显著低于处理组（图1A），说明褪黑素处理可以抑制果肉光泽度的下降。a*值增加代表果实颜色由绿转红，由于早期果肉中存在部分叶绿素未被分解，使果肉呈现一定的绿色，褪黑素处理显著抑制了a*值的上升（图1B），说明褪黑素对衰老过程中的叶绿素降解有延缓作用，这与褪黑素处理采后菜心所获得的结果[27]相似。β-胡萝卜素是芒果的主要色素成分，使芒果呈现黄色或橙黄色[28]。b*值代表果肉中黄色比重，由图1C可以观察到，对照组b*值快速下降，褪黑素处理显著抑制了b*值下降，这说明褪黑素处理延缓了鲜切芒果贮藏期间β-胡萝卜素的损失，维持了果肉的色泽。

图2 褪黑素处理对鲜切芒果硬度（A）、SSC（B）、TTA质量分数（C）和固酸比（D）的影响Fig. 2 Effect of melatonin treatment on the firmness (A), SSC (B), TTA content (C) and ratio of SSC to TTA (D) of fresh-cut mango pulp

果肉硬度、SSC和TTA质量分数是芒果重要的感官与风味指标[29]。随着贮藏时间延长，处理组和对照组果肉硬度都呈下降趋势，但相比于对照组，褪黑素处理能显著抑制鲜切芒果贮藏期间硬度的下降（图2A）。此结果与褪黑素处理桃[14]、草莓[16]、香蕉[17]和梨[18]等果实所获得的结果相一致。研究表明，细胞壁组分降解是果实硬度下降的最主要原因，而鲜切加工所导致的机械损伤可促使活性氧（reactive oxygen species，ROS）迸发，其通过非酶促方式攻击果实细胞壁，进而造成细胞壁发生降解[30]。褪黑素作为一种ROS清除剂，能够有效清除植物细胞中过量生成的ROS，进而抑制细胞壁降解和果实软化[12]。

SSC和TTA质量分数能分别反映果实的甜度和酸度。如图2B所示，褪黑素处理显著抑制了芒果贮藏期间的SSC下降，且差异达到显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）水平。如图2C所示，鲜切芒果的起始TTA质量分数为0.28%。在贮藏期间，TTA质量分数在对照组和褪黑素处理组鲜切芒果中都迅速下降，而褪黑素处理显著抑制了TTA质量分数降低（P＜0.05）。结果表明，褪黑素能有效维持果实的风味。有研究发现用苹果酸[8]和有机酸[31]等抗氧化剂处理鲜切芒果后，其对SSC和TTA质量分数的影响与本实验的结论相似。固酸比是决定果实口感和风味的重要评价指标[11,29,32]，本研究中，褪黑素处理有效延缓了固酸比的上升，这在一定程度上保留了鲜切芒果风味。

2.2 褪黑素对鲜切芒果营养品质的影响

图3 褪黑素处理对鲜切芒果β-胡萝卜素（A）和AsA（B）含量的影响Fig. 3 Effect of melatonin treatment on β-carotene (A) and ascorbic acid (B) contents in fresh-cut mango pulp

芒果含有丰富的抗坏血酸、β-胡萝卜素、酚类化合物和α-生育酚等抗氧化物质[20]。由图3可知，在贮藏期间，褪黑素处理组和对照组β-胡萝卜素含量呈先上升后下降的趋势，在贮藏的第2、3天，褪黑素处理组的β-胡萝卜素含量显著高于对照组。鲜切水果由于切面暴露于氧气、微生物、光等逆境胁迫条件下，促使β-胡萝卜素、酚类化合物被氧化，导致这些物质的结构和生物活性发生不可避免的变化。本实验表明褪黑素处理可以减缓β-胡萝卜素分解，使鲜切芒果的营养品质得以较好的保持，这一结果在Marchetti等[33]的研究中也被证实，其通过用褪黑素处理在γ射线辐照下的脂质体，发现褪黑素对低密度脂蛋白中的α-生育酚和β-胡萝卜素都有保护作用。在整个贮藏期内，褪黑素处理组和对照组果肉的AsA含量都呈先上升后下降的趋势，然而从贮藏第2天起，褪黑素处理组果肉AsA含量显著高于对照组（图3B）。研究结果表明，褪黑素处理降低了鲜切芒果果肉在贮藏期间AsA的损失，并在一定程度上维持了鲜切芒果的非酶抗氧化能力，这一结果与Liu Changhong等[16]用褪黑素处理草莓的结果相同。

2.3 褪黑素对鲜切芒果TP和类黄酮含量的影响

图4 褪黑素处理对鲜切芒果TP（A）和类黄酮（B）含量的影响Fig. 4 Effect of melatonin treatment on total phenolics (A)and flavonoids (B) contents in fresh-cut mango pulp

果肉中较高的酚含量与果实抗氧化活性密切相关。TP含量在整个贮藏期间呈不断下降的趋势，对照组的TP含量从贮藏第0天的472.34 mg/kg逐渐降低至贮藏结束时的91.29 mg/kg。整个贮藏期间，褪黑素处理的鲜切芒果中TP含量显著或极显著高于对照组（图4A）。类黄酮属酚类化合物，是植物的次生代谢产物之一[22]。如图4B所示，类黄酮含量在整个贮藏期间呈下降趋势，但褪黑素处理显著抑制了鲜切芒果类黄酮含量下降。结果表明，褪黑素处理能有效减少鲜切芒果在贮藏期间TP和类黄酮损失，进而维持了鲜切芒果的抗氧化活性与营养品质。

2.4 褪黑素处理对鲜切芒果PPO、POD活力的影响

果蔬发生酶促褐变是酚类物质发生氧化的直接结果，酚类物质在有氧条件下被PPO催化氧化为醌类物质后，醌类物质通过非酶聚合反应生成有色物质从而导致果蔬组织褐变[34]。由于鲜切加工不可避免地会造成果蔬细胞膜破坏，酚类物质与PPO和POD充分接触而发生酶促褐变。由图5可见，本研究中，对照组PPO、POD活力一直处于较高水平，直至贮藏结束，果实生物学代谢出现崩溃特征，PPO、POD活力出现下降。褪黑素处理使鲜切芒果PPO、POD活力在贮藏期间（除第4天外）一直处于较低水平，表明其能够有效抑制鲜切芒果发生酶促褐变，使处理组直至贮藏结束仍保持较高感官品质。此外，褪黑素处理可维持较高的AsA含量（图3B），而AsA可对酶促反应形成的邻醌的前体二酚进行还原，从而降低PPO活力，继而抑制褐变[32]。褪黑素通过抑制PPO和POD活力来延缓酶促褐变也在荔枝果实中也得到了证实[15]。

图5 褪黑素处理对鲜切芒果PPO（A）和POD（B）活力的影响Fig. 5 Effect of melatonin treatment on the activity of PPO (A)and POD (B) in fresh-cut mango pulp

2.5 褪黑素处理对ROS生成的影响

图6 褪黑素处理对鲜切芒果·（A）和·OH（B）生成的影响Fig. 6 Effect of melatonin treatment on the production of O－2· (A)and ·OH (B) in fresh-cut mango pulp

2.6 褪黑素处理对总抗氧化活性的影响

图7 褪黑素处理对鲜切芒果DPPH自由基清除率（A）和还原力（B）的影响Fig. 7 Effect of melatonin treatment on DPPH free radical-scavenging capacity (A) and reducing power (B) in fresh-cut mango pulp

由图7可知，在整个贮藏期间，DPPH自由基清除能力和还原力都呈不断下降趋势，但从贮藏的第1天起，褪黑素处理鲜切芒果的DPPH自由基清除能力和还原力均显著或极显著高于对照组。DPPH自由基清除能力和还原力可用来评价非酶抗氧化活性，其与TP、类胡萝卜素、抗坏血酸、生育酚等抗氧化物质含量有关[37]。本研究中，褪黑素处理能抑制鲜切芒果TP、β-胡萝卜素、AsA含量的下降，表明褪黑素能够有效维持总抗氧化活性，进而能够延缓鲜切芒果的品质下降，这与Zhang Yueying[15]和Liu Changhong[16]等用褪黑素处理荔枝和草莓获得的结果相似。

3 结 论

本研究结果表明，褪黑素（0.5 mmol/L）处理鲜切芒果可以有效维持果肉色泽和硬度，减少可溶性固形物和TTA的损失。同时，褪黑素处理延缓了鲜切芒果β-胡萝卜素、AsA、TP和类黄酮含量下降并抑制了鲜切芒果果肉中POD和PPO活力，从而延缓了鲜切芒果果肉褐变并维持其营养品质。此外，褪黑素处理降低了鲜切芒果中O2-·和·OH的生成并维持了DPPH自由基清除能力与还原力，导致果实抗氧化能力得到提高。以上研究表明褪黑素处理可有效维持鲜切芒果的贮藏品质。