云南木蠹象虫体的挥发物成分

杨 燕,杨再华,杨茂发

(1.贵州师范学院生物科学学院，贵州 贵阳 550018；2.贵州省林业科学研究院森林保护研究所，贵州 贵阳 550001；3.贵州大学昆虫研究所/贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025)

云南木蠹象(Pissodesyunnanensis)属鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)木蠹象属(Pissodes)，是贵州、云南、四川的云南松林区的重要蛀干蛀梢害虫，其生活史重叠，几乎在每个时期都有不同的虫态，各地采用人工清理结合化学、生物药剂防治该虫，防治效果各异[1-4].云南木蠹象在贵州省威宁县危害较重，内吸剂防治幼虫和蛹效果不佳，且成虫具有假死性，一有风吹草动即落入枯枝落叶层中，药剂很难喷到成虫体上，所以目前当地针对云南木蠹象的防治仍以烧毁被害枝梢为主，此方法费时、费工、费钱，同时不利于水土保持和森林生态.因此，探索有效、安全、经济的防治新方法和新技术是目前亟待解决的问题.

信息化合物在害虫治理中已经得到广泛应用，其在天敌搜寻寄主的过程中起着关键作用，该类化合物来源于寄主本身及其分泌物、与寄主相关的有机体或寄主取食的植物等[5-7].例如：白背飞虱(Sogatellafurcifera)的雌、雄成虫和卵的利它素能激发寄生蜂稻虱缨小蜂(Anagrusnilaparvatae)的触觉搜索行为[8]；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)和二化螟(Chilosuppressalis)幼虫的挥发物质对螟蛉绒茧蜂(Cotesiaruficrus)有引诱作用[9].笔者在饲养从野外采集的云南木蠹象幼虫和蛹时曾发现5种天敌寄生蜂和1种捕食性天敌[10]，这为利用信息化合物防治云南木蠹象成为可能.目前，有关云南木蠹象幼虫和蛹的挥发物成分尚未见报道，成虫挥发物仅在王斌[11]对带虫枝条挥发物的研究中有所提及.固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)技术与气相色谱质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用仪联用，已成为研究信息化学物质的重要手段[12].本试验利用该技术对云南木蠹象幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫虫体的信息化合物进行萃取、分离和鉴定，以期为利用化学生态方法防治云南木蠹象提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

采集地为贵州省威宁县秀水乡华丰村(N26.85°、E103.91°)云南松林区，海拔2 430 m.将采集的成虫装入指形管，管口塞上棉花塞，并采集带有幼虫、蛹的受害云南松枝条，带回实验室.成虫饲喂健康云南松枝条，带有幼虫、蛹的受害云南松枝条切口封蜡，都置于恒温(25±1) ℃、相对湿度70%±5%、光照周期(L∶D)14 h∶10 h的人工气候室内培养.挑选未受损的幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫供试.

1.2 仪器

美国安捷伦公司HP6890/5975CGC-MS联用仪，手动固相微萃取装置(美国Supelco公司)，100 μm PDMS萃取头，样品瓶,计时器.

1.3 固相微萃取

分别取云南木蠹象幼虫20头、蛹7头、雌成虫和雄成虫各3头，对各虫态的虫体挥发物进行固相微萃取[13-14].将测试虫体放入50 mL样品瓶中，在室温(25±1) ℃下保持30 min，使样品瓶内样品与顶空中的挥发物达到动态平衡，将装有100 μm PDMS纤维头的手动进样器针头插入样品瓶，固定好固相微萃取装置的手柄，推出萃取纤维头，顶空萃取45 min(幼虫和雌、雄成虫均在室温条件下萃取，蛹在30 ℃的平板加热条件下萃取)，快速移出萃取头并插入GC-MS进样口进行GC-MS测试，250 ℃热解析5 min.

1.4 GC-MS分析条件

GC条件：色谱柱为HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，柱温45 ℃，保留2 min，以5 ℃·min-1升温至250 ℃，保留2 min；运行时间45 min；柱前压5.07×104Pa，载气流量1.0 mL·min-1；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He(99.999%)；分流比20∶1，分流进样，溶剂延迟0.5 min.

MS条件：离子源为EI源；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；四极杆温度150 ℃；接口温度280 ℃；倍增器电压1 200 V；质量范围20～450 u.

经质谱计算机数据系统对总离子流图中的各峰检索及Nist 14、Wiley275标准质谱图核对进行定性，用峰面积归一化法测定各化学成分的相对含量[15].

2 结果与分析

2.1 云南木蠹象虫体挥发物成分分析

云南木蠹象各虫态气味挥发性成分总离子流图见图1. GC-MS分离、鉴定出的各虫态挥发性成分及相对含量见表1.

由表1可知，云南木蠹象虫体主要挥发性化合物总共23种，包括8种醇类、5种单萜、5种倍半萜、2种烷烃、2种酮类和1种酯类.不同发育阶段虫体的挥发性物质种类差异明显.幼虫含有的挥发物成分较多，达21种，包括5种倍半萜、4种单萜、7种醇类、1种酯类、2种酮类、2种烷烃物质，占总峰面积的96.16%；蛹鉴定出12种成分，包括5种单萜、4种倍半萜、1种酯类、2种醇类，占总峰面积的97.09%；雌成虫鉴定出8种成分，包括3种倍半萜、2种单萜、1种酯类、2种醇类，占总峰面积的87.63%；雄成虫含有的挥发物成分较少，仅5种，包括1种醇类、2种倍半萜、1种单萜、1种酯类，占总峰面积的64.84%.其中，幼虫挥发物组分中相对含量最大的是反式-石竹烯，达28.68%，α-蒎烯(17.03%)次之；蛹挥发物组分中相对含量最大的是α-蒎烯，达41.95%，乙酸龙脑酯(14.8%)次之；雌成虫挥发物组分中相对含量最大的是反式-石竹烯，为24.71%，α-蒎烯(23.4%)和乙酸龙脑酯(15.6%)次之；雄成虫挥发物组分中相对含量最大的是桃金娘烯醇，为22.61%，反式-石竹烯(12.69%)和α-蒎烯(15.41%)次之.

A.幼虫；B.蛹；C雌成虫；D.雄成虫.丰度是指在选定的质量范围内，离子(信号)强度的总和.图1 云南木蠹象挥发物总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatiles from P.yunnanensis

幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫挥发物中都检测到α-蒎烯、乙酸龙脑酯、刺伯烯、反式-石竹烯这4种成分.其中，α-蒎烯在蛹体挥发物组分中相对含量最高，乙酸龙脑酯在雌成虫挥发物组分中相对含量最高，而刺伯烯和反式-石竹烯则在幼虫挥发物组分中相对含量最高.对伞花烃、顺式-马鞭草烯醇、反式-马鞭草烯醇、龙脑、4-松油醇、α-松油醇、马鞭草烯酮、十四烷、香叶基丙酮、δ-荜澄茄烯这10种成分仅在幼虫挥发物中被检测到，β-月桂烯和芳樟醇这2种成分仅存在于蛹体挥发物中.各虫态挥发物组分中都含有萜烯类、酯类和醇类物质：萜烯类种类最多，且其在幼虫、蛹、雌成虫、雄成虫中的相对含量都较高，分别为73.33%、75.86%、59.58%、35.74%；醇类化合物种类在幼虫中最多，共检测出7种(表1).

在幼虫挥发物中，有8种化合物相对含量低于1%，分别为对伞花烃、1,8-桉叶素、4-松油醇、α-松油醇、马鞭草烯酮、十四烷、香叶基丙酮、δ-荜澄茄烯；在蛹体挥发物中有2种化合物相对含量低于1%，分别为β-月桂烯和芳樟醇.其中，1，8-桉叶素在幼虫、蛹和雌成虫挥发物中都被检测到，但其在幼虫中的相对含量(0.75%)比在蛹(5.93%)和雌成虫(5.85%)中的相对含量都低.昆虫所处的环境是复杂的动态系统，微量成分含量变化的原因值得关注.

2.2 云南木蠹象虫体挥发物中所含寄主植物成分分析

将云南木蠹象虫体含有的23种气味化合物与已报道的固相微萃取方法分离、鉴定出的健康云南松松针、松皮、韧皮部、木质部挥发物[10]相比较，发现有13种成分相同，包括1种烷烃、1种酯类、3种醇类、8种单萜和倍半萜，且这13种成分中有12种在受害云南松松针和松皮中也被检测到，仅柠檬烯在受害云南松松针和松皮中未被发现[10](表2).

表1 云南木蠹象不同虫态气味挥发物1)Table 1 Volatiles from different stage of P.yunnanensis

表2 云南木蠹象虫体挥发物与其寄主植物挥发物比较1)Table 2 Comparison between the identical components from the volatile compounds of P.yunnanesis and the host-plant Pinus yunnanensis

由表2看出，云南木蠹象幼虫挥发物与健康松皮、韧皮部和木质部挥发物相比，1种酯类物质(乙酸龙脑酯)和1种烷烃类物质(对伞花烃)均相同，相同的萜烯类物质分别有6(α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、刺伯烯、α-葎草烯、δ-荜澄茄烯)、5(α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、刺伯烯、α-葎草烯)和4种(α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、α-葎草烯).末龄幼虫在云南松枝干木质部及髓心化蛹，蛹体挥发物与健康木质部有6种成分相同，为α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、乙酸龙脑酯、α-葎草烯.成虫取食韧皮部汁液，与健康韧皮部挥发物相比，雌成虫挥发物有5种成分相同，为α-蒎烯、莰烯、乙酸龙脑酯、刺伯烯、α-葎草烯；雄成虫挥发物有3种成分与之相同，为α-蒎烯、乙酸龙脑酯、刺伯烯.此外，乙酸龙脑酯和α-葎草烯在云南松挥发性成分中的相对含量(不超过1.5%和0.5%[10])比在云南木蠹象虫体挥发物中的相对含量(大于2.0%)低.

云南木蠹象虫体中部分挥发物组分可能是该虫从寄主植物云南松中摄取或通过化合物转化而累积.将本试验中检测到的23种气味化合物与其他方法[16-23]鉴定出的云南松挥发性成分相比，虫体上检测到的反式-石竹烯、顺式-马鞭草烯醇、反式-马鞭草烯醇、十四烷、香叶基丙酮5种成分在云南松中未被检测到.桃金娘烯醇在松皮上被检测出[22]，但其相对含量(0.7%)比在云南木蠹象虫体中的相对含量低.

3 讨论

信息化合物在自然生态系统中对昆虫的行为调控发挥着重要作用，植食性昆虫的挥发物是天敌寻找寄主的潜在化学信息，通过它天敌可探知寄主位置、类别以及是否寄生，这些信息化合物包括萜烯、醇、醛、酯、烷烃、含硫及杂环芳香族化合物等[24-27].本试验利用固相微萃取和气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术，测得云南木蠹象各虫态挥发性组分，包括萜烯类、醇、酯、烷类和酮等，其中，萜烯类是种类最多的化合物，且其在各虫态中的相对含量都较高.

地中海粉螟(Anagastrakuehniella)上颚分泌的酮类物质能刺激天敌寄生蜂仓蛾姬蜂(Venturiacanescens)产卵[28]；稻虱缨小蜂对香叶基丙酮(0.1 mg·L-1)有显著的趋向反应[29]；α-松油醇能引诱假眼小绿叶蝉(Empoaseavitis)卵期的寄生蜂[30]；二化螟盘绒茧蜂(Cotesiachilonis)对特定浓度的芳樟醇和β-石竹烯有显著偏好[31]；橘小实蝇(Bactroceradorsalis)的3种寄生蜂对10 μg·μL-1芳樟醇、柠檬烯、石竹烯能产生触角电位反应[32]；芳樟醇对天敌寄生蜂薜荔榕小蜂(Blastophagapumilae)有吸引作用[33].在云南木蠹象虫体挥发物中也检测到酮类物质(香叶基丙酮)、α-松油醇、石竹烯、柠檬烯、芳樟醇等成分，其可能与天敌近距离定位云南木蠹象有关.

王斌[11]将带有云南木蠹象的松枝挥发物成分与健康云南松枝条的成分对比，得到16种云南木蠹象成虫挥发物组分,但仅雌成虫上发现的桃金娘烯醇与本研究相同，本研究幼虫、雌成虫和雄成虫上都检测到该成分.王超英等[34]鉴定出云南木蠹象雌虫胸部43种、腹部37种和雄虫胸部20种、腹部15种化合物，其中仅α-蒎烯、莰烯和1，8-桉叶素与本研究相同.供试昆虫的处理方法及挥发物的提取方法不同，检测的结果就会有差异.固相微萃取采用的每种萃取纤维所能吸附的成分有限，还需结合其他提取方法才能得到更加完善的昆虫挥发物组分.

本研究共鉴定出23种云南木蠹象虫体挥发性成分，但这些挥发性成分是否会影响该虫天敌的寄主定位和选择行为，仍需要通过电生理和行为学试验进一步验证.