日龄对意蜂工蜂嗅觉学习行为和学习相关基因表达的影响

邱园妹,侯梦赏,王天宝,李 喆,李至春,李志国,苏松坤

(福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002)

学习和记忆是人和动物为了维持生存所具备的必要生物学功能.学习和记忆行为通常是脑部神经参与的各种神经生理和分子机制调控的结果.人们曾经普遍认为生物个体的学习和记忆能力与其脑部发育的复杂程度呈正相关，即人或者一些大型动物相对于昆虫具备更复杂和发达的大脑，在学习记忆能力方面要比昆虫强.因此，早期的昆虫学研究领域涉及昆虫学习记忆的研究较少.但是，随着蜜蜂、果蝇、蚂蚁、蟋蟀、胡蜂等许多昆虫学习记忆相关研究的增多，证实昆虫同样拥有优秀的学习记忆能力[1-2].此外，由于昆虫的神经系统相对其他动物来说比较简单，因此蜜蜂等昆虫是目前被用于研究学习和记忆相关神经生理和分子机制的重要模型之一.

蜜蜂是自然界中重要的授粉者，是一种典型的社会性昆虫.它们具有一系列复杂的学习和记忆行为，例如蜜蜂可以识别物体的色彩、形状、气味，可以在迷宫中被训练，甚至可以做简单的加减法[3-5].劳动分工和级型分化是蜜蜂作为社会性昆虫的典型特征[6-7].在正常的蜂群中，不具有生殖功能的工蜂随着日龄的变化需要承担巢内巢外几乎所有工作[8]，除了日龄因素之外，蜜蜂的劳动分工行为还与生活的巢内外环境、个体发育状况等密切联系[9].在某些特殊情况下为了适应蜂群的需要，工蜂可以加速、减缓或者逆转分工行为[7].例如当外界蜜粉源丰富，而蜂群中采集蜂数量较少时，日龄较小的内勤蜂也能转变职能而从事采集工作.

正常蜂群中，羽化出房的新蜂3日龄内便可担任巢内的清洁工作，6日龄后王浆腺发达便可哺育小幼虫，达到12日龄时主要从事清理巢脾、酿蜜、筑造巢脾等大部分巢内工作，18日龄以后蜜蜂主要从事巢外工作，如寻找食物、采集花粉和花蜜等工作.无论蜜蜂工蜂从事巢内或者巢外工作，都需要具备一定的定向和学习能力，特别是蜜蜂嗅觉学习能力，其在蜜蜂的行为活动中起到重要的作用并得到广泛研究[10-12].在羽化出房后2～3 d，蜜蜂的嗅觉系统便发育成熟，并在个体间信息交流、联想性学习以及采集食物定位等方面发挥着重要作用[13].本研究基于蜜蜂的嗅觉系统，通过伸吻反应(proboscis extension reflex,PER)与气味建立联想性学习，进而比较不同日龄工蜂学习能力的差异.已有研究表明，蜜蜂工蜂在达到6日龄时才能拥有一定的学习能力[13].因此，本研究选用了6、12、18日龄的工蜂作为试验对象，比较不同日龄工蜂学习能力差异.此外，比较分析与嗅觉学习相关基因在不同日龄蜜蜂头部的表达差异.

1 材料与方法

1.1 供试蜜蜂

试验蜜蜂为意大利蜜蜂工蜂(ApismelliferaL.)，来源于福建农林大学动物科学学院试验蜂场.从3个不同的群势较强蜂群中分别提取1个老熟的封盖子脾，并置于恒温培养箱中(温度34.5 ℃，相对湿度70%).每天采集并使用不同颜色油漆笔标记刚出房工蜂，随后将标记好的工蜂放入原蜂群中.待标记工蜂达到6、12和18日龄时，分别将它们用饲养盒收集并用于气味联想性学习试验.

1.2 气味学习试验装置

试验装置由抽气扇、气泵、Y形橡胶管、注射器筒和气阀开关等组成(图1).其中注射器筒内放置滴有10 μL香叶醇(Geraniol，99%)的圆形滤纸片，通过打开气阀让气流进入并带出气味.

图1 气味学习装置Fig.1 Equipment for odor learning test

1.3 气味联想性学习

图2 固定用于气味学习训练的蜜蜂Fig.2 Fixed bees used for odor learning test

分别将采集的标记蜜蜂转移至透明小玻璃瓶中并置于冰上进行冷冻麻痹，待蜜蜂表现出明显的行动迟缓现象，将其取出并用布基胶带固定于特制铜管中，使其头部露出且不可随意转动，吻部可自由活动(图2).将固定好的蜜蜂置于恒温培养箱中(温度34.5 ℃，相对湿度70%)，2 h后用于气味联想性学习试验.

在进行气味联想性学习试验之前，使用糖水(1 g·mL-1)刺激工蜂触角，淘汰对糖水刺激无伸吻反应的工蜂，每个日龄组设置3组重复试验.气味联想性学习试验的训练方式参照Bitterman et al[10]创建的经典PER学习模型.将工蜂置于距离出气口处约2 cm处，使其接受9 s的空气气流刺激(排除气流影响)；第9 秒时，单独给予香叶醇气味条件刺激(conditional stimuli,CS)，持续3 s；3 s后，继续给予香叶醇气味刺激并同时使用1 g·mL-1糖水非条件刺激(unconditional stimuli,US)其触角2 s，喂食糖水2 s；第16 秒时，停止气味和糖水刺激奖励，单独给予工蜂持续11 s的空气气流刺激.整个学习训练过程时长27 s.每次训练过程间隔10 min，每只工蜂重复训练4 次(T1、T2、T3、T4).在T2、T3、T4学习训练过程中，在单独给予蜜蜂气味刺激时，若工蜂3 s内伸吻，则表明成功建立气味联想性学习，记为“+”，否则记为“-”.行为训练结束后立即将工蜂用液氮冻毙，并储存于-80 ℃用于后续荧光定量PCR试验.

1.4 学习相关基因的相对表达量

基于学习行为试验结果，将成功建立气味联想性学习工蜂样本归类为气味学习能力较强工蜂，未能成功建立气味联想性学习工蜂样本归类为气味学习能力较差工蜂.在3个日龄组内的两类工蜂中各随机抽取6个样本.使用Trizol法分别提取这两类工蜂头部总RNA，并使用Takara反转录试剂盒经反转录得到cDNA.以actin管家基因作为内参基因，比较王浆主蛋白1(majorroyaljellyprotein1,Mrjp1)、气味结合蛋白16(odorantbindingproteins16,Obp16)、气味结合蛋白18(odorantbindingproteins18,Obp18)、突触小泡胺转运体(solutecarrier18A,SLC18A)等4个与工蜂学习相关基因在学习能力较强与较差工蜂头部基因的相对表达量[18].qRT-PCR反应体系(10 μL)：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ酶5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1,表1)各0.2 μL，cDNA 0.4 μL,无RNA酶水4.2 μL.反应条件：预变性 95 ℃ 2 min；39个循环：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；溶解曲线分析：65 ℃升温至95 ℃(每5 s升高0.5 ℃).每个模板设置3次技术性重复，以无RNA酶水为模板设置阴性对照.

表1 本试验所用引物对序列信息Table 1 Information on primer sequences used in the study

1.5 统计分析

根据伸吻反应率绘制学习曲线，伸吻反应率/%=成功建立联想性学习工蜂数/试验蜜蜂数×100.伸吻率数值用平均值±标准误表示，并用t-检验(SPSS 20.0)对不同日龄组之间的学习比例进行显著性差异检验.计算4个目的基因相对表达量[14].分别对3个日龄组内学习能力较强和学习能力较差工蜂头部学习相关基因表达量进行显著性差异检验(t-检验，SPSS 20.0).图形绘制软件为GraphPad Prism 5.

2 结果与分析

2.1 学习次数对不同日龄意蜂气味学习行为的影响

试验选用6、12、18日龄工蜂为试验对象，在淘汰掉对50%糖水不反应的工蜂后，每组用于气味学习训练的工蜂数量N=34～43只.每只工蜂均进行4次学习训练过程，即T1、T2、T3、T4.在4次的学习训练过程中，3组不同日龄工蜂在第1次的训练中(T1)均未对香叶醇气味刺激表现出伸吻反应，且它们的伸吻反应率均随着学习训练次数的增加而增加，在T3、T4时趋向于平稳(图3).表明工蜂的气味学习能力随着训练次数的增加而增强，训练3次即可达到稳定的学习水平.6日龄组工蜂学习曲线始终处于12日龄组和18日龄组下方，12日龄组学习曲线与18日龄组几近重合.在第2次至第4次训练过程中，6日龄工蜂的伸吻反应率分别为30.83%、45.00%、52.5%；12日龄工蜂的伸吻反应率分别为65.57%、81.52%、80.42%；18日龄工蜂的伸吻反应率分别为63.29%、76.29%、81.66%.

2.2 不同日龄意蜂气味学习行为比较分析

在4次训练完成后，6日龄工蜂的伸吻反应率为52.50%，12日龄工蜂的伸吻反应率为80.42%，18日龄工蜂的伸吻反应率为81.66%(图4).6日龄工蜂的气味学习能力分别显著低于12日龄工蜂(P<0.05)和18日龄工蜂(P<0.05).12日龄工蜂的气味学习能力与18日龄工蜂的气味学习能力无显著性差异(P>0.05).结果表明，与日龄较大工蜂相比，6日龄工蜂尚不能表现出稳定的气味学习能力，在12日龄时已经可以表现出稳定的气味学习能力.

图3 不同日龄意大利工蜂伸吻反应率Fig. 3 Proboscis reaction rate of worker bees at different ages

2.3 学习相关基因相对表达量分析

本研究以actin作为内参基因，运用qRT-PCR技术检测与学习相关的基因(Mrjp1、Obp16、Obp18、SLC18A)在3个日龄组内学习能力较强和学习能力较差的工蜂头部相对表达量.结果如图5-7所示，6、12和18日龄组学习能力较强的工蜂头部Mrjp1的相对表达量均显著高于学习能力较弱的工蜂[P(6 d)<0.05，P(12 d)<0.001，P(18 d)<0.05].Obp16和Obp18在12日龄组表达差异均极显著[P(Obp16)<0.001，P(Obp18)<0.001]，学习能力较强工蜂头部的相对表达量显著高于学习能力较弱工蜂，但是在6日龄和18日龄表达差异均不显著(P>0.05).SLC18A只在18日龄组学习成功和未成功工蜂中表达差异显著(P<0.05)，学习能力较强工蜂脑部的相对表达量显著高于学习能力较弱工蜂.

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.图5 学习能力较强(成功)与较差(未成功)6日龄工蜂头部基因相对表达量Fig.5 Relative expression of learning-related genes in the heads of 6-day-old worker bees with strong (successful) or poor learning (failed) ability

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.图6 学习能力较强(成功)与较差(未成功)12日龄工蜂头部基因相对表达量Fig.6 Relative expression of learning-related genes in the heads of 12-day-old worker bees with strong (successful) or poor learning (failed) ability

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.图7 学习能力较强(成功)与较差(未成功)18日龄工蜂头部基因相对表达量Fig.7 Relative expression of learning-related genes in the heads of 18-day-old worker bees with strong (successful) or poor learning (failed) ability

3 讨论

本试验选用6、12和18日龄意大利工蜂作为研究对象，通过建立气味联想性学习比较它们的嗅觉学习能力.结果表明，6日龄组的学习能力弱于12日龄组和18日龄组，学习水平约50%.12日龄组的学习能力与18日龄组相当，学习结果无差异显著，2个日龄组的学习水平均达到约80%.本研究结果显示，在一定日龄范围内，工蜂的嗅觉学习能力与日龄呈正相关关系.然而在工蜂日龄达到12日龄或更高日龄时，日龄对于工蜂学习能力的影响则较小.本研究中，12日龄组的工蜂学习能力也表现出和18日龄组工蜂学习能力相当的水平.一般情况下，6和12日龄工蜂属于内勤蜂，主要负责巢内工作，18日龄时属于外勤蜂，主要从事采集等巢外工作.此前有研究显示，在某些情况下，还未达到外勤蜂日龄的工蜂会出现提前出巢采集的行为[15-16].这说明工蜂在未达到外勤蜂日龄时便可具备外出采集的能力，但因某些原因它们选择了继续从事巢内工作.工蜂在达到一定日龄时便已做好随时转变职能成为外勤蜂的准备，这也许是蜂群应对紧急情况的防御机制.此外，觅食行为通常被认为是导致外勤蜂死亡率高于内勤蜂的主要原因[8]，年轻的工蜂为了延长寿命保持群势而尽量避免低日龄出巢工作.同时，当工蜂处于12日龄或者更高日龄时，此时影响工蜂气味学习能力可能主要是一些外界环境因素，例如病毒感染、杀虫剂胁迫、营养不良等生物性、非生物性致病因子[17-19].此外，由于工蜂接受气味学习训练的次数是4次，12、18日龄组工蜂均表现出较高且稳定的学习能力，而6日龄组工蜂是否可能需要接受更多次数的学习训练才能达到类似的学习水平，有待于后续进一步研究.

Mrjp1是编码王浆主蛋白1的基因，Obp16和Obp18是2种气味结合蛋白基因，SLC18A是一种突触小泡胺转运体基因，他们都已被证明参与工蜂气味学习的过程[18,20].前人研究表明Mrjp1在工蜂脑部的蘑菇体中高表达，蘑菇体是涉及工蜂学习与记忆行为的神经中枢[21].本研究中，Mrjp1在3个日龄组内学习能力较强的个体相对表达量均高于学习能力较弱的个体，且在学习能力较强工蜂头部均表现出显著高水平表达.此外，另外3个与嗅觉学习相关的基因在理论上应当与Mrjp1一致，在各个日龄组的学习能力较强者都呈现出高表达量，但是试验结果与预期不一致，这进一步证明了Mrjp1可能是工蜂脑部成功建立气味联想性学习的关键基因，但具体的调控机制尚不清楚，需要进一步探索.SLC18A在生物体脑部贮存和释放多巴胺、五羟色胺等神经递质过程中不可或缺，在果蝇的学习和记忆过程中起着重要作用[22].在本研究中，SLC18A在18日龄组学习能力较强工蜂中显著高表达.由于18日龄组工蜂一般已开始从事巢外工作，采集蜂不仅需要具备嗅觉学习能力，还需要具备导航、定位等能力，其学习机制更为复杂.SLC18A可能不仅仅参与工蜂的气味学习过程，更可能同时调控其他的学习或记忆过程，呈现显著性下调表达的学习能力较弱工蜂或许在从事采集等巢外工作时亦会表现出较弱的导航、定向等其他能力.Obp16和Obp18这两种气味结合蛋白基因只在12日龄组不同学习状态工蜂中差异表达极显著.已有研究显示，工蜂在0～8日龄对于气味的敏感性一直在增强，而在8～15日龄则处于下降状态，此后敏感性处于稳定状态且低于8～15日龄[23].另外，Ray et al[13]研究表明，达到10日龄的工蜂更倾向于离开巢脾，对外界环境表现出探索性行为.12日龄组工蜂对于气味的敏感性更高可能正是由于这种探索性行为，从而对气味表现出强烈的反应，这可能也是Obp16和Obp18在学习能力较强的工蜂脑部呈现高表达的原因.以上说明，不同的学习相关基因在工蜂不同的发育阶段参与其嗅觉学习过程时也会随着日龄呈现出不同的表达模式.

综上表明，日龄对于工蜂的学习能力有一定的影响，但并不是工蜂学习能力的决定性因素.随着工蜂日龄的增长，劳动分工行为的转变和蜂群内外各种环境和生物因子的交互作用，最终可能影响工蜂的气味学习行为以及相关的调控机制.在蜂群内外复杂环境和生物因子存在的前提下，日龄、劳动分工和学习行为三者之间的交互作用及调节工蜂脑部活动的具体机制，仍需要进一步探索.