胃癌细胞系中CD44+胃癌干细胞的表达和意义

任芳 陈毅德 冯丽华 郑志高 范鑫 林雨标 冯水土

摘要：目的  探讨胃癌细胞系中CD44+胃癌干细胞的基因表达及其意义。方法  采用无血清培养基获得漂浮球，在胃腺癌细胞系MKN-45中用FACS检测肿瘤干细胞（CSC）表面标志物CD44的表达，采用FACS分离CD44+亚群，通过体外培养鉴定两种不同细胞群CD44+和CD44-中的致瘤、自我更新、分化特性，采用实时RT-PCR评估CD44+和CD44-中干细胞特异性基因的表达。结果  MKN-45和NCI-N87在无血清培养基中形成胃癌微球体，而KATOⅢ和AGS不能形成胃癌微球体，MKN-45细胞系经FACS分选CD44+和CD44-中细胞，80%MKN-45细胞高表达CD44;CD44+细胞在无血清培养基中显示出更高的微球体形成、分化特性;参与Wnt2、Bmi1、Oct3/4、Notch1、Sox2、Nanog和其他基因的“干细胞”基因的表达水平在CD44+亞群中高于CD44-亚群。结论  人胃癌细胞中的CD44+亚群可能含有胃癌干细胞样细胞，可为胃癌的诊断、治疗提供参考。

关键词：胃癌;CD44;胃癌干细胞;基因表达

中图分类号：R735.2                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.20.013

文章编号：1006-1959（2020）20-0045-06

Expression and Significance of CD44+ Gastric Cancer Stem Cells in Gastric Cancer Cell Lines

REN Fang，CHEN Yi-de，FENG Li-hua，ZHENG Zhi-gao，FAN Xin，LIN Yu-biao，FENG Shui-tu

（Department of Oncology and Hematology，Xiamen Haicang Hospital，Xiamen 361026，Fujian，China）

Abstract：Objective  To investigate the gene expression and significance of CD44+ gastric cancer stem cells in gastric cancer cell lines.Methods  Floating spheres were obtained with serum-free medium. FACS was used to detect the expression of tumor stem cell （CSC） surface marker CD44 in gastric adenocarcinoma cell line MKN-45， CD44+ subgroups were separated by FACS， and two different cell populations were identified by in vitro culture The tumorigenicity， self-renewal， and differentiation characteristics of CD44+ and CD44-. Real-time RT-PCR was used to evaluate the expression of stem cell-specific genes in CD44+ and CD44-.Results  MKN-45 and NCI-N87 formed gastric cancer microspheres in serum-free medium， while KATOⅢ and AGS could not form gastric cancer microspheres. The MKN-45 cell line was sorted by FACS for CD44+ and CD44- cells， 80% MKN-45 cells highly express CD44; CD44+ cells show higher microsphere formation and differentiation characteristics in serum-free medium; the expression level of "stem cell" genes involved in Wnt2， Bmi1， Oct3/4， Notch1， Sox2， Nanog and other genes CD44+ subgroup was higher than CD44- subgroup.Conclusion  The CD44+ subset of human gastric cancer cells might contain gastric cancer stem cell-like cells， which could provide references for the diagnosis and treatment of gastric cancer.

Key words：Gastric cancer;CD44;Gastric cancer stem cells;Gene expression

尽管胃癌（gastric cancer，GC）的发病率和死亡率一直下降，但它仍然是世界上第5大最常见的恶性肿瘤，2012年大约有100万新增病例，尤其普遍在东亚（主要在中国）。同时，胃癌是全球癌症死亡的第3大原因 [1]。大多数患者早期无症状或存在非特异性症状，确诊时常为晚期，日本和韩国使用钡光荧光检查或内窥镜检查，更有利于早诊断、早治疗[2]。GC被认为是一种预后不良的恶性疾病，5年生存率<30%[3]。目前GC研究的主要焦点是通过寻找新工具和技术来实现早发现、早诊断、早治疗[4]。因此，如何识别且清除早期胃癌细胞是胃癌患者早诊断、早治疗的关键。癌症干细胞（CSC）可以为胃癌诊断和治疗提供新方法。研究表明，CSCs是肿瘤起始、侵袭、远处转移和抗癌药物耐药的原因[5]，胃CSC可能在胃癌早期发挥重要作用并促进肿瘤发生进展。目前有学者推测可通过特定表面标志物的鉴定CSC [6]，其中CD44首先被確定是乳腺癌的特异性CSC标志物[7]，也已被证明是其他许多实体瘤的CSC标志物[8]，也有学者认为CD44可能也是胃CSC标志物[9]。本研究从人MKN-45胃腺癌细胞系中分离、鉴定、并培养胃CSC细胞，观察CD44+细胞的特性，评估其作为胃癌细胞表面标志物的价值。

1材料与方法

1.1细胞培养  人胃癌细胞系MKN-45、NCI-N87、KATOⅢ、AGS购自ATCC公司，置于含10%胎牛血清的1640培养基（HyClone）中培养;加入100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素（Gibco）;在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中，培养基每2 d更换1次。将细胞以80%汇合传代，并以20%汇合接种，保持最佳培养条件。

1.2胃癌微球体细胞培养  从贴壁细胞（1.0×104/ml）中提取胃癌微球体细胞，置于无血清的PRMI-1640培养基（HyClone）中，培养基含2%B27、20 ng/ml EGF（R&D）、10 ng/ml人FGF-2（R&D）和10 mM HEPES（Invitrogen）。 7～10 d后观察6孔板中的胃癌微球体细胞，并使用倒置显微镜（Olympus）以40和200放大倍数进行定量。胃癌微球体通过胰蛋白酶-EDTA溶液（GIBCO）消化，40-μm筛（BD Biosciences）过滤后获得单细胞悬液，并再次将单细胞接种。最后去除生长因子，添加10%FBS后，从胃癌微球体中获得分化细胞。

1.3流式细胞术分析和分选  CD44可作为原发性肿瘤和胃癌CSC鉴别标记[9，11-13]。本实验通过使用FACS分析人MKN-45胃腺癌细胞系的CD44表达模式。通过FACS分选培养CD44+胃癌细胞，诱导肿瘤微球体形成。培养基中加入10%FBS代替EGF和FGF-2，观测CD44的表达及其形态。步骤如下：蛋白酶消化MKN-45细胞，用PBS洗涤两次并离心，将1×106个细胞沉淀重悬于含2%FBS的PBS中，使用100倍稀释的抗人CD44-FITC小鼠单克隆抗体（克隆G44-26，BD Pharmingen）于室温下，孵育30 min后，在FACS Calibur（Becton-Dickinson）上分析样品。收集（5～10）×106个细胞并染色，并使用FACS Aria（Becton-Dickinson）分选。选染色最显著的前10%细胞和最模糊的10%细胞作为阳性和阴性对照组。FACS分选后，使用台盼蓝染色鉴别细胞活性，分选细胞含量预计高于96%。使用CD44小鼠单克隆抗体分析胃癌微球体细胞和分化细胞的CD44表达。

1.4 RT-PCR分析CD44+和CD44-胃癌细胞参与干细胞相关途径的基因表达情况  按照试剂盒说明书，使用Trizol试剂（Invitrogen）从CD44+和CD44-细胞中提取总细胞RNA。取1 μg总RNA，通过oligo（dT）18引物，反转合成cDNA，按照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）试剂盒说明书进行。反应体系包含：0.1 μM正向和反向引物以及SYBR Green PCR混合物（Applied Biosystems）进行RT-qPCR。具体引物序列如下：CD44正向引物：TCCAGGCAACTCCTAGTAGTA，反向引物：CTGTCCCTGTTGTCGAAT;Wnt2正向引物：ACTCTCAGGACATGCTGGCT，反向引物：ACGAGGTCATTTTTCGTTGG;Bmi1正向引物：TGGAGAAGGAATGGTCCACTTC，反向引物：GTGAGGAAACTGTGGATGAGGA;Notch1正向引物：CCTGAGGGCTTCAAAGTGTC，反向引物：CGGAACTTCTTGGTCTCCAG;Oct4正向引物：CTGGAGAAGGAGAAGCTGGA，反向引物：CAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG;Sox2正向引物：TGCGAGCGCTGCACAT，反向引物：CGGGCAGCGTGTACTTATCC;Nanog正向引物：CAACCAGACCCAGAACATCC，反向引物：TTCCAAAGCAGCCTCCAAG;C-myc正向引物：TCAAGAGGCGAACACACAAC，反向引物：GGCCTTTTCATTGTTTTCCA;ABCG2正向引物：TGGCTTAGACTCAAGCACAGC，反向引物：TCGTCCCTGCTTAGACATCC;CXCR4正向引物：GAGTGGCCGACCTCCTCTT，反向引物：ACATGGACTGCCTTGCATAGG;GAPDH正向引物：ACCCACTCCTCCACCTTTGA，反向引物：CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT。具体操作如下：在95 ℃变性，5 min后，反应在95 ℃下进行40个延伸、扩增循环。通过7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）进行信号检测。以GAPDH基因作为内参，根据2-△△CT法计算目的基因相对表达量。每组重复实验 3 次，使用Microsoft Excel计算平均值和标准差。

1.5统计学方法 应用SPSS 23.0软件对所有的实验数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验;采用双侧检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2结果

2.1胃泌素形成不同的人胃癌细胞系  MKN-45和NCI-N87细胞显示直径约100μm的经典球状集落，KATOⅢ细胞形成少量集落，而AGS细胞系不能形成球状集落并死亡，见图1。

2.2 CD44+干细胞相关基因的表达  MKN-45细胞显示出高水平的CD44表达，高达82%细胞表达CD44;随后通过FACS从MKN-45细胞系中分选出CD44+和CD44-细胞，分选的细胞的纯度大于96%，见图2。“肿瘤干性”基因包括CD44、Wnt2、Bmi1、Notch1、Oct4、Sox2、Nanog、C-myc、转运蛋白和运动基因（ABCG2、CXCR4），在CD44+中表达高于CD44-细胞亚群，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。相对于CD44-细胞，CD44+细胞形成更多、更大的微球体，差异有统计学意义（P<0.05），见图4、图5。CD44+ MKN-45细胞在无血清细胞培养基中培养，以维持未分化状态，培养10～14 d后，通过倒置相差显微镜观察形成漂浮的微球体，见图6。此外，胃癌球体在第3次细胞培养传代后生长为更大、更紧凑的微球体，见图7。培养1 d后，漂浮的胃微球体迁移为贴壁细胞，贴壁细胞获得与其亲本MKN-45非常相似的多边形形态，见图8。流式细胞术分析胃癌微球体和分化的贴壁细胞表明，在分化过程中CD44表达从98%降低至85%，见图9。

3讨论

癌症干细胞为具有无限增殖、分裂、多向分化潜能的细胞亚群[14]。最早在急性髓性白血病中发现了CSC，其中CD34+ CD38-亚群具有干细胞增殖分化能力[15]，越来越多的证据表明CSCs存在于各种实体肿瘤中，包括乳腺[7]、结肠直肠[16]、肺[17]、头颈部[18]、胰腺[19]、肝[20]、胃癌[9]、胶质瘤[21]、前列腺[22]等。因此，癌症干细胞的检测对癌症患者的准确诊断和有效治疗具有重要意义。寻找细胞表面标志物是鉴定和分离CSC最重要方法，流式细胞术或磁性细胞分选已在许多实体恶性肿瘤中成功分离CSC。然而，实体瘤CSC表面识别标志物的确定无疑是CSC领域最困难的挑战[6]。大多数用于分选的标记物是经验性，且源自正常干细胞。最近已有报道分离、鉴定胃CSC的各种技术和细胞表面标志物[13，23-26]，其中CD44是用于胃CSC最具有潜力标记物之一。CD44是Ⅰ类跨膜糖蛋白，可以作为细胞外基质如透明质酸的受体。CD44因其在介导细胞-基质相互作用以及与恶性过程相关的重要功能，尤其是癌症转移中的重要作用而备受关注[27]。HA-CD44在细胞外结构域中的相互作用激活了多种信号通路，涉及CSC自我更新、克隆形成、抗凋亡/存活，放化疗抗性等[28]。 CD44单独或与其他标记物组合鉴定CSC已应用于許多肿瘤中，如乳腺癌[7]、胰腺[29]、结肠直肠[30]、肺[31]、肝细胞[32]、卵巢[33]、头颈部[34]等。Takaishi等通过分析一组人类GC细胞系，在CD44+细胞亚群中鉴定出CSC[9]。与CSC的定义标准一样，从5个GC细胞系中的3个细胞系中分选出CD44+细胞，在悬浮状态下形成球状集落，以及在SCID小鼠的胃和皮肤中形成异种移植肿瘤。因此，本研究试图通过CD44富集MKN45细胞中收集可能存在的CSC。许多研究人员使用荧光激活细胞分选来鉴定和分离CSCs，确定其在特定的无血清培养基中形成球体。本课题组通过FACS从MKN-45细胞系中分选出CD44+和CD44-细胞，发现CD44+细胞在体外显示出更高胃癌微球体形成效率，与相关报道结果一致[9]。此外，CD44+细胞能够在无血清培养基中作为胃癌微球体增殖，并在10%FBS存在下分化，表明它们保留了自我更新能力和分化潜能。

目前研究已在多个癌症中检测到干细胞相关基因（也称为“肿瘤干性基因”），其可解释CSCs的自我增殖、分化特性[35]。因此，开发有效的诊断、治疗方法首先需确定CSC中有活性、特异的分子标志物。据报道，这些基因的失调及其信号通路的变化参与了胃癌的发生发展。通过RT-PCR（qRT-PCR）技术可分析CD44+和CD44-胃癌细胞之间“干性基因”的mRNA表达差异。本研究发现，与CD44-亚群相比，CD44+胃癌细胞群高表达的“干性基因”包括CD44、Wnt2、Bmi1、Notch1、Oct4、Sox2、Nanog、C-myc、转运蛋白和运动基因，如ABCG2和CXCR4[36-39]。研发能够特异阻断这些与CSC增殖、分化和转移相关基因的药物将增强肿瘤的治疗效果并改善预后。同时对这些基因进行深入研究，进一步阐明它们对CSCs的确切作用以及其与胃癌的关系具有重要意义。然而，一些胃癌细胞系本身含有高比例的CD44+癌细胞，这与当前的CSC模型不一致，可能与CSC尚未完全纯化，且标志物特异性不足有关[40]。本研究中，MKN-45细胞显示出高水平的CD44表达，高达80%。此外，肿瘤块内可能存在多个CSC亚群，可能需要多个标记物的组合来识别完整的CSC群体[41]。最近已报道LGR5 +（GPR49+）干细胞位于胃窦区域，持续分化为所有胃窦细胞[42]。本研究还分析了干细胞相关基因LGR5在胃癌细胞系中的表达，但并未发现LGR5在CD44+和CD44-肿瘤细胞中表达的差异。因此，LGR5可能不是胃癌CSC标记。

总之，MKN-45细胞中存在CSC，FACS是分离和鉴定胃癌CSC的有效手段。然而，由于胃CSC的特异性表面标志物未知，异种移植肿瘤模型是鉴定CSCs的金标准，因此需要进一步的DNA高通量测序和体内实验来鉴定潜在的胃癌干细胞标志物，这可能有助于早期诊断和更有效的胃癌靶向治疗。

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收稿日期：2020-09-02;修回日期：2020-09-12

編辑/成森