马尾松林下种植五指毛桃的生长评价

陈英之，李良波，甘凤琼，黄荣韶

（1. 广西大学农学院，广西 南宁 530004 ；2. 广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200）

林药种植是根据林下不同环境条件，将适宜林下生长的药用植物重新引种到林下进行半野生化栽培[1]。五指毛桃为桑科榕属植物粗叶榕（Ficus hirtaVahl），入药部分为其地下根茎，是地道的民族药材，被《中华人民共和国药典》1977 版收载[2]。补骨脂素为五指毛桃质量评价的主要指标成分[4-6]，佛手柑内酯为次要指标成分[8]。补骨脂素具有抗血凝、扩张冠状动脉、降压、止咳、抑制肿瘤、防御紫外线损伤、免疫调节等作用[8-9]。五指毛桃具有健脾补肺、舒筋化湿之功效，对脾虚浮肿、盗汗、肺痨咳嗽、风湿痹痛、肝硬化腹水、慢性支气管炎和产后无乳等症有特殊疗效[2-3]。目前,五指毛桃人工种植比较少，药材来源主要依靠野生资源。近年来，随着五指毛桃需求量的增加，市场供不应求，致使五指毛桃遭到掠夺式的采挖，野生资源日渐枯竭，给环境和资源造成巨大压力。马尾松（Pinus massoniana）是广西分布面积最大的造林树种，面积达231.6 万hm2。成龄的马尾松树林具有一定的荫蔽度，适合耐阴植物生长。五指毛桃为小乔木，多生于海拔500 ～1 000 m 的灌丛山谷、林缘、疏林或村寨附近湿润温暖之地[10]。五指毛桃具有一定的耐阴性，从生态角度来看五指毛桃适合在成龄马尾松林生长。

林药种植充分利用林地资源，多层次立体结构能够提高光能利用率和空间利用率，同时还能提高土壤肥力，改良土壤理化性质，改善生态环境，达到良性循环[11-12]。倪乐[13]研究了不同树种套种模式对雷公藤甲素含量动态变化、林地土壤养分变化等，认为厚朴林下套种雷公藤模式可以增加雷公藤根和叶中的雷公藤甲素含量，厚朴林下套种雷公藤可以提高林地土壤的全氮含量。李娟等[14]在橡胶林下间作五指毛桃，科学合理施肥，既有利于五指毛桃的生长发育，又有利于橡胶树胶乳产量的增加。目前，关于林下种植五指毛桃的研究比较少，马尾松林下种植五指毛桃的研究尚未见报道。笔者对马尾松林下不同生长年限五指毛桃的生长表现进行综合评价，并对不同年份的五指毛桃主要活性成分含量进行分析，为马尾松林下规模化种植五指毛桃的最佳采收时期提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地安排在南宁市邕宁区那楼镇广泽健康产业种植基地，属天然马尾松林地，地处亚热带季风区，东经108°35'，北纬22°38'，海拔高度不足100 m，日照充足，雨量充沛，年平均气温21.8℃，年平均降水量1 472.1 mm，无霜期长，雨季多集中于4—9 月。试验地属于丘陵山地，山体坡度约为25°，土壤以红壤为主，土层深厚，肥沃, 腐殖质含量较丰富。

1.2 试验材料

1.2.1 供试种苗供试种苗购置于广西灵山县伯劳镇远丰苗木基地，经广西中医药大学黄荣韶教授鉴定，确认为五指毛桃（Ficus hirtaVahl）。

1.2.2 仪器及设备e2695 高效液相色谱（waters）、KQ-500DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、色 谱 柱（waters Symmetry C18，4.6×250 mm，5 μm）、Milli-Q 超纯水制备仪（美国Millipore 公司）、SHZ-D Ⅲ循环水式多用真空泵（上海力辰邦西仪器科技有限公司）、Basis Hei-VAP HL 旋转蒸发仪（Heidolph）、游标卡尺（上海精美量具厂）、 BSA224SCW 分析天平（德国Sartorius）、DHG-9240A 烘箱（上海一恒科学仪器有限公司）、卷尺等。

1.2.3 试 剂标准品补骨脂素（中国药品生物制品检定所，批号110739-201918，纯度为99.60%），标准品佛手柑内酯（中国科学院成都生物研究所/成都曼斯特生物科技有限公司，批号19063003，纯度为99.37%），水为超纯水，其他试剂均为分析纯 。

1.3 试验设计

五指毛桃于2016—2019 年每年3 月在基地内划区种植，离松树2 m，种植密度为60 cm×60 cm，深15 cm×宽25 cm 开穴，以充分腐熟的厩肥2 kg 作基肥，与细土混匀施入穴内。种植区域生态环境基本一致，移栽时种苗大小一致，管理方法一致，2020 年2月测量生长状况及补骨脂素和佛手柑内酯含量（移栽时的小苗作为CK）。

1.4 考察指标及方法

1.4.1 植物学性状测定主要测定马尾松树林下种植1～4 a 的五指毛桃的株高、基径、侧根数、根长、最大根径、地上部鲜（干）重，地下部鲜（干）重等指标。其中，地上部干重和地下部干重的测定：将鲜样置于105℃烘箱里杀青30 min 后，转到55℃下烘至恒重后称量。每个生长年限选10 株大小均匀，根、茎、叶齐备的五指毛桃进行测量，取平均值。试验数据采用Excel 和SPSS 软件进行分析。

1.4.2 化学成分含量测定将五指毛桃根系样品烘干后粉粹过40 mm 筛，用高效液相色谱法检测不同生长年限样品补骨脂素和佛手柑内酯的含量。（1）标准品溶液的制备。精密称取补骨脂素标准品17.75 mg，佛手柑内酯标准品3.7 mg，加甲醇超声使其溶解，分别制成1.775 mg/mL 的补骨脂素和0.37 mg/mL 的佛手柑内酯标准品溶液，0.45 μm 滤膜过滤。（2）样品溶液的制备。取五指毛桃粉末0.5 g，精密称定，置于50 mL 具塞锥形瓶中，精密量取10 mL 甲醇，超声波提取30 min，定容至10 mL，0.45 μm 滤膜过滤。（3）检测波长的选择。取补骨脂素和佛手柑内酯标准品溶液通过紫外全波长扫描，根据最大吸收峰确定适宜的检测波长。（4）其他色谱条件。色谱柱为waters Symmetry C18( 4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水（60 ∶40）；流速1.0 mL/min，柱温35℃，进样量10 μL。（5）标准曲线制备。精密称取补骨脂素标准品和佛手柑内酯标准品溶液，用流动相溶液进行稀释，分别制备浓度梯度为1.775、3.55、7.1、14.2、28.4、56.8 mg/L 的补骨脂素标准品溶液和浓度梯度为0.37、0.74、1.48、2.96、5.92、11.84 mg/L 的佛手柑内酯标准品溶液，在试验确定的色谱条件下进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标，以标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线。（6）样品的稳定性。样品制备后，分别于0、1、2、4、8、12 h 取样测定，考察样品的稳定性。（7）检测方法验证。精密吸取标准品溶液，按照试验确定的方法进行检测，取相同浓度标准品重复测定5 次，以验证方法的精密度；精密称取同批次五指毛桃样品5 份，制备待测样品溶液，分别测定补骨脂素和佛手柑内酯的含量，以验证方法的重复性；精密称取同批次五指毛桃样品5 份，精密加入补骨脂素（0.887 5 mg/mL）和佛手柑内酯（0.187 5 mg/mL）标准品1 mL，按样品制备方法制备样品溶液，分别测定补骨脂素和佛手柑内酯的含量，计算样品的加标回收率。

2 结果与分析

2.1 样品中补骨脂素和佛手柑内酯的检测方法确定

试验结果显示，补骨脂素在245 和222 nm 处吸收比较强，佛手柑内酯在222 nm 处吸收较强，故选择222 nm 作为补骨脂素和佛手柑内酯2 种物质的共同检测波长。在该波长处，补骨脂素和佛手柑内酯标准品的保留时间分别为16.705 和25.556 min，五指毛桃样品中补骨脂素和佛手柑内酯的保留时间分别为16.566 和25.353 min（图1），分离度良好。研究采用外标法计算样品中的补骨脂素和佛手柑内酯含量，通过标准曲线绘制，获得补骨脂素和佛手柑内酯的回归方程分别为Y=44 939.02X+0.308，r=0.999 99 和Y=60 244.50X-0.251，r=0.999 97。研究验证了样品的稳定性，结果显示制备0～12 h 的样品中补骨脂素和佛手柑内酯峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.85%、0.96%，表明供试样品溶液在12 h 内稳定。研究还验证了检测方法的精密度和重复性，结果显示在该检测条件下，补骨脂素和佛手柑内酯峰面积的RSD 均低于1.5%，表明检测方法的精密度、重复性良好。加标回收试验结果显示，补骨脂素和佛手柑内酯平均加样回收率分别为99.7%（RSD=1.85%）和99.4%（RSD=1.97%），表明该检测方法准确可靠。

图1 五指毛桃中补骨脂素和佛手柑内酯的高效液相色谱结果

2.2 马尾松林下不同生长年限五指毛桃植物学性状比较

由表1 可知，在相同生态环境条件下，五指毛桃株高随着生长年限的增加而增加，不同生长年限的五指毛桃株高差异显著。一年生至四年生的五指毛桃株高逐年增长量分别为64.80、159.21、97.01、11.87 cm。四年生的株高最高，平均达341.35 cm，四年生的株高较三年生增加3.60%，三年生的较二年生增加41.73%，二年生的较一年生增加217.32%。可以看出，移栽后1～2 a 五指毛桃株高增加最快，是五指毛桃速生期，其次是第3 年，第4 年的株高增长缓慢。

不同生长年限的五指毛桃基径差异显著，生长年限越长，主茎越粗。二年生至四年生的五指毛桃基径分别为2.27、3.09、3.35 cm；三年生的基径比二年生平均增粗36.12%，四年生的基径比三年生平均增粗8.41%，四年生的基径年增粗率比三年生降低。二年生、三年生的五指毛桃基径增粗显著，四年生的差异减小，基径增粗速度减慢。

五指毛桃侧根数随着生长年限的增加呈先快后慢的增长趋势。一年生和二年生的侧根数增加明显，说明五指毛桃侧根的数量增加主要在一年生和二年生阶段，四年生与三年生的侧根数差异不显著。

不同生长年限五指毛桃根长差异显著。四年生的根长最长，平均达131.72 cm，四年生的五指毛桃根长较三年生增加7.67%，三年生的较二年生增加11.36%，二年生的较一年生增加229.42%。可以看出，二年生的五指毛桃侧根长得最快，其次分别是三年生和四年生。这与株高生长动态有些相似，说明移栽后1～2 a 五指毛桃株高和根长进入速生期。

表1 不同生长年限的五指毛桃主要生长性状

表2 不同生长年限五指毛桃生物量变化动态 （g/株）

不同年限五指毛桃最大根径差异显著，生长年限越长，最大根茎越粗。二年生至四年生的五指毛桃最大根径分别为1.40、2.12、2.63 cm，三年生的最大根径与二年生的相比，增粗51.75%，四年生的比三年生增粗24.06%，二年生和三年生的根径增粗率大，四年生的增粗率相对较小。

2.3 不同生长年限五指毛桃生物量变化动态

由表2 看出，不同生长年限鲜重和干重都差异显著，与生长年限呈正相关关系。一年生至四年生的五指毛桃平均每株鲜生物量（地上部鲜重+地下部鲜重）分别为780.33、2 850.55、3 567.91、3 990.18 g，平均每株干生物总量（地上部干重+地下部干重）分别为246.00、1 047.38、1 565.78、2 021.85 g，二年生至四年生的鲜生物量分别较上一年增加2.65、0.25、0.12倍，干生物总量分别较上一年增加3.26、0.49、0.29 倍。五指毛桃生物量随着生长年限的增加而增加，二年生的五指毛桃增长率最大，四年生的较三年生的增长速率有所降低。

五指毛桃以根部入药，地下部是收获目标，也是光合产物积累和储藏的重要器官，五指毛桃根部生物量大小决定着产量和经济效益。从表2 可以看出，一年生的五指毛桃幼苗移栽后，由于前期幼苗植株小，地上部生物量少，光合产物积累能力弱，限制了五指毛桃的生长速率，植株生长缓慢，到二年生后，进入旺盛生长期、大量积累光合产物，生物量迅速积累，总生物量迅速上升，增长量最大，之后随着生长年限的增加，增长量呈现递减趋势。

2.4 不同生长年限对五指毛桃的补骨脂素和佛手柑内酯含量的影响

不同生长年限五指毛桃块根的补骨脂素和佛手柑内酯含量有差异，说明生长年限对其质量有影响。由表3 看出，同一生长年限五指毛桃块根的补骨脂素含量高于佛手柑内酯含量。三年生的五指毛桃块根中的补骨脂素和佛手柑内酯含量较二年生和四年生的含量高。补骨脂素含量的高低顺序均为：一年生＞三年生＞四年生＞二年生，佛手柑内酯含量的高低顺序均为：一年生＞三年生＞二年生＞四年生。

表3 不同生长年限五指毛桃补骨脂素和佛手柑内酯含量比较

3 结论与讨论

五指毛桃主根垂直向下生长，当长到一定程度时，生长缓慢，从根颈长出一定数量的侧根。侧根斜向下或者横着生长，侧根数量多且生长快。侧根数、侧根长和侧根直径决定五指毛桃的产量，因此以侧根作为地下部生长性状的测定对象，发现马尾松林下二年生的五指毛桃株高、基径、根长、最大根径和生物量进入速生期，地上部鲜重平均值为1 860.38 g，地下部鲜重平均值为720.17 g，三年生增长量次之，说明五指毛桃可以在马尾松林下进行林药种植。

一年生五指毛桃块根的补骨脂素和佛手柑内酯含量较高，可能是一年生的五指毛桃根较细小，以根皮为主，根茎量少。钟镜金等[15]研究发现五指毛桃根皮的补骨脂素和佛手柑内酯含量明显高于根茎的含量。《中国药典》尚未收录五指毛桃质量标准，没有参考补骨脂素和佛手柑内酯含量标准。马雅婧等[16]建议参照药典高效液相色谱法（附录Ⅵ D）测定五指毛桃补骨脂素和佛手柑内酯含量，补骨脂素含量不低于0.05%。

林药种植块根类中药材，需考虑中药材的产量和经济效益。林下粗放式种植中药材，没有施用农药和化肥，属于仿野生种植，一般的野生药材，由于生长年份不详，采收时大多为不同年限的药材混合品，药材质量差异大，林下种植可以避免这种缺陷，选择在药材最佳采收年限进行采收，达到质量均一、提高药用效果的目的。补骨脂素和佛手柑内酯作为评价五指毛桃质量的重要依据，过早采收使得产量过低、药用活性成分相对积累较少；采收过迟往往导致过于老化、品相差等。而补骨脂素和佛手柑内酯在一年生含量最高，之后含量下降，三年生又比二年生的含量高，表明五指毛桃活性物质含量不是生长年限越长越高，而是生长到一定年限后不再增加，反而降低。因此，选择适宜的采收时期有利于品质的保证，三年生的五指毛桃补骨脂素和佛手柑内酯含量较高，兼顾地下部分干物质积累量，建议宜采收三年生的五指毛桃入药。