UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS非定向筛查贝类中氮杂螺环酸毒素及其代谢产物*

吴海燕 陈佳琦 董晨帆, 2 王 松 崔海栋 谭志军

UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS非定向筛查贝类中氮杂螺环酸毒素及其代谢产物*

吴海燕1陈佳琦1董晨帆1, 2王 松3崔海栋3谭志军1①

(1. 农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071; 2. 上海海洋大学食品学院 上海 201306; 3. 青岛卫辽医用生物材料有限公司 青岛 266071)

为了分析复杂贝类和微藻中的氮杂螺环酸毒素(AZAs)及其代谢产物, 建立一种基于超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱(UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS)联用技术的非定向筛查分析方法。采用Full MS/dd MS2、PRM和Target-SIM/dd MS2三种质谱鉴定模式, 整合多种数据采集挖掘策略, 通过研究多种AZAs在不同基质样品中的质谱裂解规律及特征碎片离子丰度, 实现AZAs及其衍生物的快速筛查检测和精准鉴别。结果表明: PRM模式能有效排除AZAs同分异构体的干扰, 获得更高的专属性, 适用于目标代谢物筛查; 应用Full MS/dd MS2和PRM结合的方式, 根据AZAs裂解途径及多种AZAs代谢产物裂解规律, 在贝类中共鉴别出20种AZAs系列化合物, 其中包括初步推测了3种新型AZAs代谢产物的结构。应用本方法还发现AZA9、AZA10、AZA19等代谢物均随代谢过程持续升高, 是AZA2在贝类代谢过程中的末端产物。该方法能够为复杂基质中的AZAs系列毒素及其衍生常规检测与精准鉴别提供参考, 可应用于解析AZAs毒素在贝类体内的代谢转化机制研究。

氮杂螺环酸毒素; 贝类; 高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱; 代谢

氮杂螺环酸毒素(azaspiracids, AZAs)是一类具有独特聚醚类螺环结构(图1)的脂溶性贝类毒素, 具有毒性强、残留高且代谢慢等显著特点, 因此成为国际研究热点和管控重点(EFSA, 2008; Furey, 2010; Hess, 2016; Pelin, 2018)。AZAs主要由环胺藻(spp.)产生, 通过食物链传递到海洋贝类中, 并经贝类的生物转化作用产生多种代谢产物, 从而对消费者带来食用安全风险(Hess, 2016)。一般来说, 环胺藻产生的AZAs组分主要为AZA1、AZA2和AZA3中的一种或两种(Rossi, 2017;Krock, 2019), 也是毒性最强的三种组分(Pelin, 2018)。最新研究确定产毒藻原生AZA多达26种(Tillmann, 2017; Krock, 2019), 且经过贝类代谢(Jauffrais, 2013; Ji, 2018)后可形成超过50余种的代谢产物(Miles, 2018), 而且部分代谢产物如AZA17和AZA19的毒性较高(Krock, 2015)。贝类中AZAs的组成及其毒性强度总和决定了产品食用安全性, 因此采用高通量AZA及其代谢产物筛查方法进行检测与安全性评估尤为重要。

图1 Azaspiracids毒素的化学结构

AZAs的检测方法包括液相色谱法、液相色谱串联质谱法、酶联免疫检测方法(Samdal, 2015; Leonardo, 2017)等。由于毒素标准品的匮乏, 仅能分析鉴别AZA1—3三种组分, 而多达40余种的代谢产物尚缺少标准物质(吴海燕等, 2016)。同时, 贝类制品的基质较为复杂, 目前仅通过前处理过程增加如QuECHERS 技术(韩深等, 2013)、固相萃取柱等净化方法, 虽可显著降低贝类基质干扰, 但在代谢物非定向筛查和鉴定中, 仍存在不同程度的基质干扰效应, 给定性鉴别来带一定困难。近年来, 线性离子阱、静电场轨道阱以及飞行时间高分辨质谱(韩深等, 2014)在多毒素筛查、代谢产物的发掘和结构鉴定等方面均有广泛应用。其中, Rehmann等(2008)使用超高效液相色谱串联质谱法确定了AZA12-32的结构; 基于高分辨串联质谱与核磁共振的鉴别技术也同时应用于新型毒素371鉴定(Rehmann, 2008; Kilcoyne, 2014)、AZA7—9 (Kilcoyne, 2015)、AZA26、AZA33、AZA34和AZA37 (Kilcoyne, 2018)等新型AZAs代谢产物结构鉴定。但目前的检测方法较为单一, 主要是限量3种毒素定量方法和单一化合物结构鉴定方法, 缺乏系统的非定向筛查与确证方法。

本研究利用固相萃取净化前处理, 结合超高效液相色谱－线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱整合全扫描二级质谱模式Full MS/dd MS2、目标离子扫描二级质谱模式Target-SIM/dd MS2、平行反应监测模式PRM模式等多种数据采集、挖掘策略快速分析方法, 分析贝类样品中的AZAs及其代谢产物, 解析质谱裂解规律及特征碎片离子组成, 为研究贝类中AZAs的代谢机制提供了快速、直观和准确的参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈(HPLC级, 美国Merk公司); 乙酸铵(HPLC级, 美国Sigma Aldrich公司); 超纯水(18.2MΩ·cm); Strata-X固相萃取柱(200mg/6mL, 美国Waters公司), 其他未作特殊说明的试剂均为分析纯。AZA1 [CRM-AZA1, (1.24±0.07)g/mL], AZA2 [CRM- AZA2, (1.28±0.05)g/mL], AZA3 [CRM-AZA3, (1.04± 0.04)g/mL]以及AZA阳性基质样品, 其各组分含量分别为AZA1 (1.16μg/g), AZA2 (0.273μg/g)和AZA3 (0.211μg/g), 购自加拿大国家研究理事会海洋生物科学研究所。

腹孔环胺藻()为我国海域分布的AZA产毒藻(Krock, 2014), 具有独特的AZA组成(Krock, 2019), 由国家海洋局第三海洋研究所提供。实验室以f/2培养液单种培养, 温度(20±1)°C, 光照6000lx, 光暗比12h︰12h。经检测该藻主要产生AZA2, 单细胞产度能力一般为(7.05± 0.52)fg/cell。

栉孔扇贝()产自青岛市胶南灵山湾养殖海域的2龄贝(67mm±8mm)进行腹孔环胺藻(AZA2产毒藻)暴露试验(吴海燕等, 2017), 分别取3、7和22d内脏团样品, 均质后冷藏于-18°C, 作为AZA代谢实验样本。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱联用仪(UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS): 美国赛默飞世尔公司产品, 配有加热喷雾离子源(HESI)、Xcalibur 2.1化学工作站以及Compound discovery 2.1数据比对分析软件; Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱系统: 美国赛默飞世尔公司产品, 配有变色龙色谱工作站。Himac CR 22GⅡ高速离心机(日本Hitachi公司); N-EVAP 112氮吹仪(美国Organomation公司); Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司); 57250-U固相萃取装置(美国Supelco公司)。

1.3 仪器检测方法

1.3.1色谱条件 色谱柱: Kinetex XB-C18 (100mm×2.1mm, 2.6μm); 柱温: 40°C; 流速: 0.30mL/min; 进样量: 5μL; 流动相: A为0.15% (/)甲酸水溶液, B为乙腈; 洗脱梯度: 0—7.0min, 20%— 90% B; 90% B持续3min; 10.0—10.1min, 90%—20% B; 20% B持续1min。

1.3.2 质谱条件 加热电喷雾离子源(HESI), 正离子模式; 喷雾电压: 3.5kV; 毛细管温度320°C; 加热器温度: 50°C; 鞘气: 40arb; 辅助气: 5arb;

扫描模式: Full MS/dd MS2与Target-SIM/dd MS2: 采集范围250—1500; 一级全扫描(Full MS)分辨率为70000FWHM, C-trap最大容量(AGC target): 5×105, Maximum IT时间: 100ms; 数据依赖二级子离子扫描(dd-MS2)分辨率为17500FWHM, C-trap最大容量(AGC target): 1×105, C-trap最大注入时间: 50ms。碰撞能量CE为30、50、70。

平行反应监测模式PRM模式: 采集范围250—1500; C-trap最大容量(AGC target): 2×105, Maximum IT时间: 100ms; 碰撞能量CE为30、50、70。

1.4 样品制备方法

称取(2.00±0.02)g样品, 分别用3 mL甲醇提取3次, 离心后合并上清液, 于40°C氮吹至约1mL, 加入3mL超纯水待净化。依次用1mL甲醇、1mL 30% (/)甲醇水溶液活化Strata-X 固相萃取柱, 然后加入提取液, 再用1mL 20% (/)甲醇水溶液淋洗, 最后用1mL 0.3% (/)氨水甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 用甲醇定容至1mL过0.22μm滤膜, 上机分析。

1.5 数据采集与处理

本研究运用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技术整合多种数据采集、挖掘策略, 对复杂贝类基质中AZAs及其代谢产物筛查与鉴别。首先, 比较全扫描二级质谱模式Full MS/dd MS2、目标离子扫描二级质谱模式Target-SIM/dd MS2、平行反应监测模式PRM模式采集方法, 确定标准品与基质样品中的裂解规律和特征碎片; 应用Full MS/dd MS2筛查与PRM目标鉴定, 结合精确分子质量和文献信息, 共鉴别出20种具有AZAs母核结构的化合物; 选择不同质量段碎片离子, 通过PRM的子离子扫描模式, 设置最大分子质量误差为5×10–6, C、H、O 和N原子数目的范围分别为20—50、40—80、5—15和1, 实现了未知代谢产物筛查的功能, 通过高能碰撞(HCD)采集方法, 对疑似AZAs代谢产物进行精细区分和结构鉴定。对确证后的AZA代谢物采用半定量方法进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 标准品与基质样品中AZAs的质谱裂解规律

在LTQ-Orbitrap MS HESI源电离正离子检测模式下(分辨率70000), AZA1、AZA2和AZA3的准分子离子峰为[M+H]+。典型的AZAs的二级碎片离子特征碎片主要包括: [M+H]+、[M+H-nH2O]+、[M+H-H2O- C9H10O2R1R3]+, 特征离子包括672.4106 (AZA-3658.3954)、462.3214 (AZA-3448.3050)和362.2690等(图3)。AZAs分子电离产生的最小结构离子碎片为发生RDA (Retro-Diels-Alder)反应的A环断裂。除此以外, 其结构中不同碎片均产生脱H2O, 在高能诱导裂解HCD下, 多采用分子离子的脱水峰(18u)作为特征离子, 也可作为定性的判定依据。在HCD裂解下, MS2图谱中产生了A、D、E、G环等碎片离子。其中362.2707的特征碎片结构式为C22H36NO3+(Δ-1.03×10–6)是目前已鉴定结构AZA化合物特有碎片离子(除AZA36和AZA39外)。

由于贝类的基质效应造成的干扰, 使在实际检测过程中造成假阳性现象。研究应用多种数据采集、挖掘策略, 包括Full MS/dd MS2、PRM和Target- SIM/dd MS2三种鉴定模式, 比较了基质溶液中AZAs的质谱裂解规律。其中Full MS/dd MS2能获得部分主要裂解碎片, 但特异性差。通过建立已知结构的AZAs化合物Inclusion条件, 采用PRM和Target- SIM/dd MS2检测模式, 在四级杆过滤掉大量干扰离子提高了灵敏度的同时, 显著提高二级高分辨质谱选择性, 灵敏度更佳。比较而言, PRM所获得离子碎片信息更为丰富, 且响应提高1个数量级, 贝类基质干扰得到有效排除。因此, 采用目标筛查PRM AZA基质标准物质在不同扫描模式下AZA2的特征碎片(图2)。

2.2 AZAs代谢产物的快速筛查和鉴别

通过甲醇提取, 固相萃取柱净化前处理过程, 针对强残留能力的脂溶性AZAs代谢物进行分离提取。运用LTQ-Orbitrap MS仪PRM数据采集方法, 比较代谢物的精确分子质量、保留时间以及AZAs二级碎片离子碎裂规律与特征碎片对代谢样品进行快速筛查和鉴定。共鉴别出了20种AZAs代谢产物, 结果见表1 (化合物1—20)。AZAs代谢产物类型包括分子结构中的C3和C23的羟基化, C8和C22甲基化及羧基化代谢产物(Rehmann, 2008)。结合色谱保留行为和文献报道发现, 经过贝类的代谢作用, 与母体化合物(AZA2)相比, 多种代谢产物的极性增加(Krock, 2015), 在反相色谱柱上的保留时间提前, 从而在代谢过程中更易于排出体外。

在代谢产物样品中, 检测到目标858.4998通道, 保留时间分别为5.51和6.18min的两种成分, 其高分辨质谱中显示的精确分子离子峰分别为858.5062 (Δ0.62×10–6)和858.5115 (Δ1.36×10–6), 与理论分子量比对质量精度均小于3×10–6, 初步判定为同分异构体AZA9和AZA10 (吴海燕等, 2018), 为AZA2在贝类基质的代谢中间过程的上游代谢产物。其中, AZA9(RT 5.51min)在R1位发生羟基化反应(图4), 而AZA10在R4位发生羟基化反应, 因此其[M+H-H2O-C9H10O2R1R3]+碎片不同, 分别为658.3991和674.4143, 差值为一个O(16u)原子。该碎裂模式与AZA9和AZA10结构匹配。

图2 不同扫描模式下基质标准物质中AZA2质谱图

注: a: Full MS/dd MS2模式; b: Target-SIM/dd MS2模式; c: PRM模式

图3 PRM模式下AZA2质谱裂解途径

已知AZA19为AZA2 R3位发生羧基化产物, 其分子离子丰度为886.4965 (Δ1.95×10–6), 其A环断裂碎片为658.3951 (Δ0.26×10–6); AZA19的R2位发生去羰基化反应后的AZA17, 其A环断裂碎片为670.3940 (Δ-1.45×10–6)(图5)。通过上述裂解规律分析860.4791通道, 分别在5.17和5.38min有两个同分异构体化合物, 精确分子离子峰分别为858.5062 (Δ0.62×10–6)和858.5115 (Δ1.36×10–6), 其碎片2的分别为C44H54O4N 660.3935 (Δ-1.82×10–6)和C45H46O5672.4135 (Δ-2.61×10–6)丢失C (12u)碎片, 判定该化合物为AZA13同分异构体, 为R1位发生羧基化反应。

716.4727通道中, 保留时间为6.34min的化学成分, 其结构中有丰富的去H2O (18u)碎片, 且362.2689碎片与AZAs的C22H36NO3+(Δ- 0.18×10–6),462.3224碎片与AZAs的C27H44NO5+(Δ2.10×10–6)符合AZA的基本的碎裂模式, 将该化合物鉴别为AZA33, 其多级质谱图及裂解规律示于图6。

图4 m/z 858.4998提取离子流图和二级质谱图

注: a: 提取离子流图; b: RT 5.51化合物二级质谱图; c: RT 6.18化合物二级质谱图

图5 m/z 860.4791提取离子流图和二级质谱图

注: a: 提取离子流图; b: RT 5.17化合物二级质谱图; c: RT 5.38化合物二级质谱图

图6 m/z 716.4727提取离子流图和二级质谱图

注: a: 提取离子流图; b: RT 6.33化合物二级质谱图

2.3 代谢实验样品分析

应用Full MS/dd MS2和PRM结合的方式, 对AZAs代谢实验解毒器官——内脏团样品(O’Driscoll, 2014)进行代谢产物筛查鉴定分析。共鉴别11种AZA代谢产物, 主要成分包括AZA2、AZA6、AZA9、AZA10、AZA11、AZA12、AZA19、AZA23以及3种新型AZAs成分。对3种新型AZAs成分查阅文献比对裂解方式,844.4842初步鉴定为AZA4和AZA5的同分异构体, 888.4740为AZA21的同分异构体。通过该检测方法获得检测结果与液相色谱-四极杆/线性离子阱复合质谱(吴海燕等, 2016)比较, 灵敏度更高, 定性更为精准。AZA12和AZA19为主要的代谢产物, 在3d代谢样品中含量比例分别为5.9%和2.6%, 主要以AZA2形式存在(含量为84.0%)。在7d代谢样品中, 共检测到9种代谢产物组分, AZA2含量显著降低, 约为66.9%, AZA12和AZA19含量升高, 含量分别为11.5%和9.8%。至代谢22d样品中, 检出全部11种代谢产物。其中部分代谢产物如AZA9, AZA10, AZA19均随代谢过程持续升高, 是AZA2在贝类代谢过程中的末端产物。因此, 应用本方法对促进AZAs的代谢进程具有重要的作用。

表1 贝类基质中AZA代谢产物的质谱裂解信息及鉴定

Tab.1 Characterization of AZA metabolites in the shellfish

综上可见, 脂溶性AZAs在贝类基质体内, 以多种代谢物形式进行代谢转化, 代谢产物极性增加, 当残留能力较强, 可长时间残留在基质样品中。由于目前多种AZAs代谢产物的毒性当量因子未知, 因此整体增加贝类对消费者食用安全的风险性, 需加以重视。

3 结论

本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS高分辨质谱技术建立了多种数据采集模式、挖掘策略用于AZAs及其代谢物质的精准筛查。分析比较标准品和基体标准物质, 共获得20种AZAs系列化合物二级碎片信息, 初步推测了3种新型AZAs代谢产物的结构。应用该方法分析AZA2在贝类中的代谢轮廓, 共检测出11种AZAs, 其中AZA12和AZA19为主要的代谢上游产物。该方法能够实现复杂基质中的AZAs的精准鉴别, 可为AZA的代谢机理研究提供参考。

表2 扇贝代谢实验样品AZAs组成及含量

注: 用AZA2标准品进行相对定量

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UNTRAGETED SCREENING OF AZASPIRACIDS AND ITS METABOLITES IN SHELLFISH AND TOXIN PRODUCING ALGAE BY UHPLC-LTQ-ORBITRAP

WU Hai-Yan1, CHEN Jia-Qi1, DONG Chen-Fan1, 2, WANG Song3, CUI Hai-Dong3, TAN Zhi-Jun1

(1. Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3.Qingdao Value & Value Medical Biomaterial Co., Ltd, Qingdao 266071, China)

Azaspiracids (AZAs), one kind of lipid-soluble shellfish toxins, with the lowest provisional acute reference dose (ARfD) and relative high toxicity among all kinds of shellfish toxins, are easily accumulated to high levels in shellfish and can persist for long periods. Consumption of AZAs contaminated shellfish could cause severe acute gastrointestinal poisoning, posing threats to public health, and concerns on quality of shellfish products. In recent years, AZAs contamination has become a worldwide problem. AZAs producing microalgae are extensively distributed around the coasts of China, resulting in increased AZAs accumulation in shellfish. It is therefore necessary to assess the potential risk of AZAs in shellfish. However, the mechanism for AZAs detoxification in human remains poorly documented, and often generates inaccurate safety assessments. In this study, ultra-high-performance liquid chromatography linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry (UHPLC-LTQ-Orbitrap) was used to integrate the untargeted screening analysis method of AZAs and its metabolites in shellfish. The mass spectrum characterization of AZA standard solution and positive matrix samples was analyzed for routine detection and accurate identification in three identification modes: Full MS/dd MS2, PRM, and target-SIM /dd MS2. The results show that PRM could effectively eliminate the interference of isomers and obtain higher specificity. Non-target high-throughput screening analysis by Full MS/dd MS2and the PRM were conducted for metabolic samples. Twenty AZA species and three new AZA metabolites were identified from various samples. Therefore, this method can provide a reference for accurate routine detection of AZAs in complex matrixes and for studying the metabolic transformation mechanism.

azaspiracid; shellfish toxin; ultra-high-performance liquid chromatography linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry (UHPLC-LTQ-Orbitrap); metabolite

* 国家重点研发计划资助, 2017YFF0211103号; 国家自然科学基金, 41806138号。吴海燕, 助理研究员, E-mail: wuhy@ysfri. ac.cn

谭志军, 博士生导师, 研究员, E-mail: tanzj@ysfri.ac.cn

2020-03-06,

2020-04-23

O656.22

10.11693/hyhz20200300057