食品大肠菌群检验中培养基验证方法的探讨

□ 谢 甜 陈 亚 重庆市涪陵食品药品检验所

培养基是微生物检验中的主要耗品和材料。从培养基自身的质量来看，不同生产厂家的产品，甚至同一厂家不同批号的产品都会存在差异；依 据GB/T 27050—2008《检 测 和 校准实验室能力的通用要求》，对培养基的供应企业进行评价后选择合格的供应商，这是培养基购买过程中的重要步骤。做好培养基和试剂的检查工作，对确保微生物的生长、分离、鉴定与检验结果的正确性具有关键性的作用。因此，需要对培养基和试剂的质量进行检查，以控制好培养基和试剂的质量[1]。培养基验证是微生物实验室质量控制的关键环节，验证结果直接影响检验结果的准确性和质量，而大肠菌群是最为常见的检测项目也是必检项目，与人们的饮食健康息息相关，因此大肠菌群检测的准确性至关重要[2]。参照GB 4789.28—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》[3]，从食品大肠菌群检验中培养基的验证入手，阐述培养基验证的具体操作流程，为实验室内部的质量控制提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 培养基

1.1.1 待验证培养基

结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA），批号：190812，厂家：北京陆桥技术股份有限公司；月桂基磺酸盐胰蛋白胨肉汤（LST），批号：180509，厂家：北京陆桥技术股份有限公司；煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB），批号：190517，厂家：北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.2 其他培养基（已验证合格的培养基）

营养肉汤，批号：190829，北京陆桥技术股份有限公司；营养琼脂，批号：190422，北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 菌株信息

大肠埃希氏菌CICC 10305，中国工业微生物菌种保藏管理中心；粪肠球菌CICC 23658，中国工业微生物菌种保藏管理中心；弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864，KWIKSTIK。

1.3 仪器与设备

BSP—400L 培养箱（S.15.17），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BHC—1300 ⅡA2 型生物安全柜（S.17.3），苏州安泰空气技术有限公司。

2 培养基验证方法

2.1 培养基制备

将VRBA 培养基制好后倒入平皿，冷却备用。将LST 培养基分装试管，每管10 mL；将BGLB培养基分装试管，每管10 mL。灭菌后备用。

2.2 工作菌悬液制备

菌悬液A：将大肠埃希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌和粪肠球菌菌株分别接种到营养肉汤中，36 ℃下培养24 h，即得3 种工作菌悬液A。

菌悬液B：菌悬液A 中的这3种工作菌悬液分别稀释10、100、1 000 与10 000 倍，制备浓度为105～107CFU/mL 的菌悬液作为工作菌悬液；大肠埃希氏菌106CFU/mL 为工作菌悬液适宜浓度。弗氏柠檬酸杆菌，106CFU/mL 为工作菌悬液适宜浓度。粪肠球菌105CFU/mL 为工作菌悬液适宜浓度。

2.3 VRBA 培养基验证

2.3.1 生长率测试

接种：用1 μL 接种环分别挑取菌悬液A 中的大肠埃希氏菌菌悬液和弗氏柠檬酸杆菌菌悬液各一环在VRBA平板上划线，各接种两个平板，按图1所示；在36 ℃培养箱培养24 h。

计算：每条有比较稠密菌落生长的划线则生长指数G 为1；仅一半的线有稠密菌落生长，则G 为0.5；若划线上没有菌落生长、生长量少于划线的一半或菌落生长微弱，则G 为0；记录每个平板的得分总和便得到G总。

VRBA 生长率测试实验结果如下。

大肠埃希氏菌（平均值）G总=7.5（要求G总≥6），特征性反应：大肠埃希氏菌有沉淀环的紫红色菌落。

弗氏柠檬酸杆菌（平均值）G总=7（要求G总≥6）。

2.3.2 选择性测试

接种：用1 μL 接种环取菌悬液A 中的粪肠球菌工作菌悬液1 环，在VRBA 平板上划线，如图2，同时接种两个平板。在36 ℃培养箱培养 24 h。

计算：每条有比较稠密菌落生长的划线则生长指数G 为1；仅一半的线有稠密菌落生长，则G 为0.5；若划线上没有菌落生长、生长量少于划线的一半或菌落生长微弱，则G 为0；记录每个平板的得分总和便得到G总1。

VRBA 选择性测试实验结果：粪肠球菌（平均值）G总1=3；（要求G总1＜5）。

2.4 LST 培养基验证

2.4.1 测试

用1 μL 接种环各取一环菌悬液B直接接种到LST 培养基中，在36 ℃培养48 h。

2.4.2 结果解释

目测浊度值评估培养基，0 表示无混浊；1 表示很轻微混浊；2 表示严重的混浊。

图2 非目标菌半定量划线法接种模式

生长率：大肠埃希氏菌浊度值=2（产气）；弗氏柠檬酸杆菌浊度值=2（产气）。

选择性：粪肠球菌浊度值=0。

2.5 BGLG 培养基验证

方法与LST培养基验证完全相同。

3 结论与分析

3.1 VRBA 培养基验证结论

3.1.1 标准要求

生长率测试：大肠埃希氏菌G ≥6，且在VRBA 平板上有特征性反应；选择性测试：弗氏柠檬酸杆菌G ≥6，粪肠球菌G ＜5。

3.1.2 结论

VRBA 培养基验证结果满足上述要求，验证结论合格。

3.2 LST 培养基验证结论

3.2.1 标准要求

大肠埃希氏菌：混浊度为2，且管内有气体；弗氏柠檬酸杆菌：混浊度为2，且管内有气体；粪肠球菌：浊度0（不生长）。

3.2.2 结论

LST 培养基验证结果满足上述要求，验证结论合格。

3.3 BGLB 培养基验证结论

标准要求与LST 一样，验证结论为合格。

3.4 分析讨论

培养基验证过程中，也会出现不满足实验要求的情况，应该从以下几个方面考虑：①试验菌种，试验菌种是否是目标菌，这一点涉及菌种的验收是否合格，此外还要考虑菌种是否具有较强的生长力，最好是新鲜活化的。②操作规范，因为涉及3 种菌株，在生物安全柜中同时操作极易造成交叉污染，对实验准确度的影响极大，建议在不同的生物安全柜中操作，条件不允许的情况下可以分批次进行菌悬液的制备。③培养基自身的质量问题。对微生物检验来说，主要采用商品化脱水合成培养基。因此在采购商品化脱水合成培养基时，应仔细检查外观产品批号、有效期、培养基的pH 值、包装完整性等等，做好接收记录。对于新开封的培养基，应记录首次开封日，并在开封后6 个月内用完。

4 结论

微生物种类很多且较复杂，检验结果的真实性与准确度会受到培养基质量的直接影响，培养基的验证是内部质量控制的重要一环，本次实验对GB 4789.28—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》中阐述的方法进行了细化，对实验的可操作性进行了全面而具体的分析，尽管本次实验的结果是满意的，但实验中还是存在各种风险，对实验中的注意事项和可能存在的风险进行了总结与分析，为实验室内部质量控制提供了良好的依据。