奶牛炎性子宫局部T淋巴细胞亚群分析与活化

付博凡，谢彤彤，张翘楚，姚鑫鑫，李志明，袁梦仪，郭 勇，肖龙菲，倪和民，王相国

(北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206)

子宫内膜炎是引发高产奶牛不孕和不育的常见原因，导致分娩后卵巢机能障碍，延长黄体期并降低了受孕率[1]。在过去的50年中，为提高牛奶产量，奶牛被人工进行了基因选择，导致其对子宫疾病的易感性和生育力下降[2]。

T淋巴细胞在保护身体抵抗病原体方面起着至关重要的作用[3]。T细胞按照功能主要分为辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞。T淋巴细胞在骨髓中产生，从那里迁移到胸腺以完成成熟过程。然后，幼稚的T淋巴细胞在血液和次级淋巴器官之间循环，直到它们接触其特定抗原为止。

调节性T细胞(Treg)对于外周免疫耐受以及预防自身免疫和组织损伤至关重要。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员[4]。在调节性T细胞中也发现了CTLA4，并有助于它们的抑制功能。PD-1是第一个被鉴定为正在经历细胞死亡的T细胞杂交瘤中上调的基因[5]。PD-L途径提供抑制信号，该信号调节中央和外周T细胞耐受性[6]。Galectin-1是Galectin家族中最普遍表达的成员[7]，涉及先天和适应性免疫的调节，并存在于细胞内和细胞外[8]。Galectin1的细胞外功能在很大程度上依赖于碳水化合物的结合特性[9]。已知Galectin-1抑制巨噬细胞活化[10]，促进T细胞的选择性凋亡[11]。激活后Galectin-1表达的增加将解释在抑制发生之前先激活调节性T细胞的需求[12]。Galectin-1结合糖蛋白在T细胞表面的能力与抑制的非抗原特异性相一致[13]。

就此，首先研究了子宫内膜炎症对正常子宫局部免疫细胞亚群的影响，进而分离筛选健康牛子宫局部Treg细胞，通过检测与LPS刺激子宫内膜上皮细胞来源外泌体共孵育过程中CTLA4，Galectin-1和PD-1变化来探究其对Treg细胞的活化作用,探明子宫内膜炎对奶牛子宫局部免疫功能的影响，进而阐明子宫内膜炎导致奶牛屡配不孕的内在影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料分离与培养及其检测

收集健康与患病子宫分泌物采用迪夫快速染色液进行细胞涂片染色。之后，剥离子宫背膜，使用牛脏器组织淋巴细胞分离试剂盒(索莱宝)分离淋巴细胞，并置于RPMI Medium 1640培养基(含 10%无外泌体胎牛血清和双抗)，37 ℃，5%CO2细胞培养箱中悬浮培养，隔天送流式鉴定(北京科悦达生物科技有限公司)与分选(北京博云辉生物科技有限公司)。

主要试剂：基础培养液RPMI Medium 1640(Solarbio公司)、无外泌体胎牛血清(Exosome-depleted FBS Media Supplement，System Biosciences公司)、脂多糖(LPS，Sigma公司)、牛脏器组织淋巴细胞提取试剂盒(Solarbio公司)，外泌体(Exosomes)提取试剂盒(贝博公司)。

1.2 子宫内膜炎奶牛子宫内部剖检与细胞学鉴定

取新鲜的健康与患病子宫的1只子宫角切开，观察子宫内膜形态，颜色以及炎性变化。另1只用PBS冲洗取腔液涂片，用迪夫染色液A和B进行染色。

1.3 流式细胞仪进行淋巴细胞亚群鉴定

依照索莱宝公司牛脏器组织淋巴细胞提取试剂盒操作，提取子宫内淋巴细胞提取第2天，将培养皿中的细胞悬液吸入15 mL离心管送检。

1.4 流式细胞仪进行淋巴细胞分选获得调节性T细胞

依照索莱宝公司牛脏器组织淋巴细胞提取试剂盒操作，提取子宫内淋巴细胞提取第2天，将培养皿中的细胞悬液吸入15 mL离心管送北京博云辉生物科技有限公司进行流式分选，最终获得调节性T细胞。

1.5 正常外泌体和LPS处理外泌体培养调节性T细胞

将流式细胞仪分选出的调节性T细胞细胞移入24孔板中的6孔，每3孔分别加入100 μL，采用外泌体提取试剂盒(贝博公司)提取的正常培养子宫内膜上皮细胞来源外泌体(对照组)和LPS处理子宫内膜上皮细胞来源外泌体(刺激组)处理24 h。

1.6 荧光定量PCR检测基因表达

将外泌体处理24 h后的两组细胞分别提取RNA，测定OD值，并进行荧光定量PCR测定，检测正常外泌体和LPS处理外泌体培养调节性T细胞中CTLA4、PD-1和Galectin-1的表达。

2 结 果

2.1 子宫内膜炎奶牛子宫内部剖检与细胞学鉴定

奶牛子宫剖检结果显示，健康子宫，未见明显病变反应(图1-a)；患子宫内膜炎子宫内膜颜色暗红，有肿胀凸起，并伴有粘性分泌物(图1-b)。迪夫快速细胞染色结果显示，健康组仅有脱落的上皮细胞(箭头所示)，腔液中未见嗜中性粒细胞浸润(图1-c)；患病子宫腔液内有大量成簇的嗜中性粒细胞浸润(图1-d，三角所示)。

注：a 健康奶牛子宫内部剖检图; b子宫内膜炎奶牛子宫内部剖检;c健康奶牛子宫腔液细胞涂片; d子宫内膜炎奶牛子宫腔液细胞涂片.箭头指示脱落的上皮细胞，三角形指示嗜中性粒细胞

2.2 子宫内膜炎奶牛子宫局部淋巴细胞亚群数量分析

由图2可知，患子宫内膜炎子宫内各个T淋巴细胞亚型(辅助性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞)数量均极显著高于健康子宫内同一T淋巴细胞亚型数量(P<0.01)。

2.3 子宫内膜炎奶牛子宫局部淋巴细胞亚群比例分析

由图3可知，健康子宫与子宫内膜炎子宫内各T细胞亚群比例差异不显著(P>0.05)，而辅助性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞比例发生了明显的变化，其中细胞毒性T细胞由健康时的(23.22±3.12)%上升至(42.01±5.67)%(P<0.01)，调节性T细胞由健康时的(8.01±1.99)%下降至(2.00±0.91)%(P<0.01)，辅助性T细胞由健康时的(19.61±2.30)%下降至(5.05±1.01)%(P<0.01)。

2.4 子宫内膜上皮细胞来源外泌体对调节性T细胞活化的影响

如图4所示，qRT-PCR检测发现，加入LPS处理组(刺激组)中的CTLA4、Galectin-1和PD-1三种基因的表达极显著低于正常外泌体处理组(对照组)(P<0.01)。

3 讨 论

子宫内膜炎是危害奶牛业生产发展的主要产科方面疾病，严重的影响了牛的健康和繁殖性能，造成了严重的经济损失。淋巴细胞是免疫反应的核心。当机体组织器官发生炎症时，淋巴细胞会向炎症部位聚集，并发挥免疫作用。T淋巴细胞是参与抑制炎症发生的淋巴细胞的主要成分之一。本研究发现炎症的发生能够促使T淋巴细胞增殖，同时T淋巴细胞亚群的比例也会随之发生变化。Treg是T细胞的一个非常重要的亚群，Treg的数量不足会导致免疫调节异常的迹象[14]。目前对于调节性T细胞与子宫内膜炎之间的关系的研究少之甚少。因此，通过对Treg细胞的数量及其相关调控因子在炎症前后的表达，可以作为预防奶牛子宫内膜炎的参考之一。

CTLA4是调节性T细胞表达其功能必不可少的一部分。在一些研究中发现，Treg细胞的抑制作用很大程度上取决于CTLA4。

Treg的产生，其抑制特性以及与其他细胞的相互作用可以通过其表面上的程序性细胞死亡-1(PD-1)表达以及与程序性细胞死亡配体-1之间的结合来调节。涉及PD-1的变化而导致的Treg的缺陷可导致疾病的发生与发展。PD-1也能直接促进T细胞白介素-10的分泌[15]以及抑制树突状细胞的成熟[16]。

图2 子宫内膜炎奶牛子宫局部淋巴细胞亚群数量分析

图3 子宫内膜炎奶牛子宫局部淋巴细胞亚群比例变化

Galectin-1在调节炎症反应和免疫耐受的过程中起着关键作用，具有强大的免疫抑制特性。它在不促进细胞增殖的情况下维持幼稚T细胞的存活[17]，还对活化的T细胞具有抗增殖作用[18]。Galectin-1也被认为是非常符合CD4+CD25+调节性T细胞的效应分子[19]。

总之，本研究证实在炎症条件下，调节性T细胞中表达耐受的PD-1、CTLA4和Galectin-1相关基因表达量出现降低。说明在调节性T细胞对机体的免疫抑制能力的减弱影响了机体的免疫耐受，从而使T淋巴细胞无法完全抑制炎性分子导致子宫内膜炎的发生，为探明子宫内膜炎对奶牛子宫局部免疫功能奠定理论基础。

图4 子宫内膜上皮细胞来源外泌体对调节性T细胞活化的影响